Para comenzar, tome 10 mililitros de la muestra de agua de diatomeas en un tubo de centrífuga. Centrifugar el tubo a 13.400 G durante cinco minutos. Con una pistola de pipetas, deseche con cuidado 9,8 mililitros del sobrenadante.
A continuación, transfiera 200 microlitros de la muestra de agua de diatomeas enriquecida a un tubo de centrífuga de dos mililitros. A continuación, tome 0,5 gramos de tejido del margen pulmonar de un cuerpo humano ahogado. Con unas tijeras, corte el tejido pulmonar hasta que se vuelva fangoso.
Para la extracción de ADN de muestras de diatomeas y pulmones, primero agregue perlas de vidrio a ambas muestras. Después de mezclar bien las muestras, agregue 40 microlitros de proteinasa K a los tubos. Después de una incubación de 15 minutos a temperatura ambiente, agregue 200 microlitros de tampón aglutinante a ambos tubos.
Mezcle inmediatamente las muestras con un mezclador de vórtice durante cuatro minutos. Luego coloque los tubos en un baño de agua a 70 grados centígrados durante 10 minutos. hasta que la solución se aclare.
A continuación, transfiera la solución transparente con precipitado floculante. en una columna de adsorción de tres centímetros de largo empaquetada con matriz de silicio. Centrifugar la columna a 8.000 G durante 30 segundos.
A continuación, deseche el líquido residual en el tubo de recogida y vuelva a colocar la columna en el tubo de recogida. Ahora agregue 500 microlitros del tampón de eliminación de inhibidores en la columna y centrifugue a 13, 400 G durante 30 segundos. Después de desechar el líquido residual, agregue 700 microlitros del tampón de lavado a la columna y vuelva a centrifugar.
Después de desechar el líquido residual, vuelva a colocar la columna de adsorción en el tubo de recolección vacío. Centrifugar la columna a 14.500 g durante dos minutos para eliminar la mayor cantidad posible de tampón de lavado. Ahora saque la columna y colóquela en un tubo de centrífuga limpio.
Agregue 100 microlitros de tampón de elución a la parte media de la membrana de adsorción. Centrifugar la columna a 13.400 G durante un minuto después de una incubación de cinco minutos a temperatura ambiente. Transferir la solución obtenida en el tubo de recolección nuevamente a la columna de adsorción antes de centrifugar nuevamente.
Almacene el ADN de diatomeas eluido a una temperatura de dos a ocho grados centígrados para su uso futuro. La electroforesis en gel de agarosa mostró bandas de ADN de diatomeas entre 250 y 500 BP tanto en muestras de agua como en tejidos después de la amplificación por PCR.
