Para desarrollar un método LC-TIMS ToF MS/MS para analizar péptidos proteolíticos de histonas, acople un HPLC equipado con una columna C-18 con un instrumento comercial TIMS ToF MS con tecnología pasiva patentada. A continuación, establezca las condiciones de funcionamiento de ionización por nanoelectrospray en 4, voltaje capilar de 500 voltios, desplazamiento de la placa final de 800 voltios, presión del nebulizador de tres bares, gas seco de 10 litros por minuto y calentador seco de 200 grados centígrados. Configure los ajustes de MS en energía de colisión de seis electronvoltios, RF de colisión de 1200 VPP, tiempo de transferencia de 75 microsegundos y almacenamiento previo al pulso de cinco microsegundos.
Ajuste el volumen de inyección a 20 microlitros, correspondientes a ocho microgramos de la muestra, y ajuste el caudal a 0,4 mililitros por minuto. Después de introducir la línea de tiempo de gradiente especificada y la prueba de acetónido con porcentajes de ácido fórmico al 0,1 %, seleccione Aceptar en ambos cuadros emergentes para guardar el método. Ejecute un gradiente de LC no lineal de 60 minutos con agua y acetonitrilo, ambos con ácido fórmico al 0,1 %.
Verifique la elución de la muestra de la HPLC en el ToF de TIMS mediante ionización por nanoelectrospray en modo de ionización positiva. Para identificar secuencias peptídicas y sitios de modificación bajo la herramienta MS-Digest, genere una lista teórica de péptidos utilizando Protein Prospector. A continuación, realice un resumen teórico teniendo en cuenta las condiciones de digestión, el tipo de modificaciones postraduccionales, el rango de tamaño de los péptidos, el rango de detección de masas y el número potencial de escisiones perdidas.
Para analizar los datos adquiridos, busque las masas en varios estados de carga, que van de más uno a más cuatro, para cada péptido teórico. Después de identificar cada relación masa-carga, seleccione el pico y confirme el MSMS utilizando una lista teórica de iones de fragmentación basada en la secuencia peptídica. Incluyendo modificaciones post-traduccionales.
Los espectros de fragmentación de los péptidos revelaron tres variantes peptídicas diferentes con varias modificaciones postranscripcionales, incluidos los grupos propionilo y acetilo, en diferentes posiciones. La histona H3 estándar con propionilla exhibió péptidos más largos que la versión no modificada. Las histonas extraídas de las células HeLa S3 mostraron múltiples patrones de modificación postraduccional en las mismas posiciones de aminoácidos.
