Para empezar, pipetear 3,75 mililitros de medio sérico reducido en un tubo marcado con la letra A y diluir el medio con 105 microlitros del reactivo de transfección. Agite el contenido del tubo para mezclarlo bien. A continuación, agregue 3,75 mililitros del medio sérico reducido en un tubo etiquetado como B. Diluya los plásmidos de expresión con 90 microlitros de reactivo potenciador.
Ahora agregue el contenido del tubo A al tubo B y pipetee la solución para mezclar bien antes de la incubación. Retire con cuidado 10 mililitros de medios de cultivo celular de una placa ecológica Phoenix preparada. A continuación, añada todo el volumen de la mezcla de transfección al plato gota a gota.
Incubar las células a 37 grados centígrados en una incubadora. Coloque el medio de cosecha viral MTCM en un baño de agua a 37 grados centígrados para precalentarlo. Ahora incline la placa ecológica Phoenix y pipetee el medio de cultivo.
A continuación, pipetee lentamente 30 mililitros del medio de cosecha viral precalentado en la placa inclinada. Vuelva a colocar las células en la incubadora. Después de 48 horas de transfección, coseche el sobrenadante viral.
Filtrarlo a través de filtros de PVDF de 0,45 micrómetros. Con la parte posterior de una jeringa estéril, triture el bazo murino aislado a través de un colador de células de 70 a 100 micrómetros en un tubo cónico de 50 mililitros. A continuación, lave el colador con cinco mililitros de tampón de aislamiento de células T.
Después de llevar el volumen final de las células a 50 mililitros, cuente las células con el hemocitómetro. Granular las células por centrifugación durante 10 minutos a 450 G a cuatro grados centígrados o a temperatura ambiente. Vuelva a suspender el gránulo celular que contiene los esplenocitos con el kit de aislamiento de células T recomendado.
A continuación, aísle las células T positivas para CD3 mediante selección negativa. Transfiera el aislado separado magnéticamente a un tubo cónico de 15 mililitros. Vuelva a comprobar el recuento de células.
Centrifugar las células T aisladas durante 10 minutos a 450 G a cuatro grados centígrados. A continuación, vuelva a suspender el gránulo celular en el medio de activación MTCM. Ahora agregue perlas magnéticas recubiertas de anticuerpos e interleucina-2 a la suspensión celular para activar las células T.
Incubar las células a 37 grados centígrados durante la noche. En el día cero, recubra previamente las placas estériles de 24 pocillos no tratadas con 0,5 mililitros de reactivo potenciador de la transducción de fibronectina humana. Guarde los platos a cuatro grados centígrados durante la noche.
Al día siguiente, retire el reactivo de transducción de los pocillos. Bloquee los pocillos con un volumen igual de PBS estéril filtrado y suplementado con BSA durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de la incubación, retire el BSA PBS y lave los pocillos con 0,5 a un mililitro de PBS.
A continuación, agregue un mililitro del retrovirus puro a cada pocillo prerrecubierto. Centrifugar la placa a 2.000 G durante 90 minutos a 32 grados centígrados. A continuación, añada un mililitro de las células T activadas a cada pocillo cargado de virus.
Centrifugar las placas de nuevo a 450 G durante 10 minutos a 32 grados centígrados. Incubar la placa a 37 grados centígrados durante la noche. Al quinto día, vuelva a suspender las células para disociar las células T activadas de las perlas recubiertas de anticuerpos.
Coloque la suspensión de la celda en un imán durante 30 segundos. A continuación, transfiera la suspensión a un recipiente de cultivo ex vivo. Coloque los recipientes en una incubadora a 37 grados centígrados antes del análisis citométrico de flujo.
El uso del kit de aislamiento de células T produjo purezas de células T inferiores al 98% antes de la transducción. Se lograron tasas de expresión de CAR reproducibles del 65 al 75%. Los cultivos ex vivo con interleucinas-7 y 15 condujeron a una activación de 15 veces al día 10 a partir de un solo bazo.
El cultivo de las células T con las interleucinas condujo a frecuencias comparables de células T CD8 positivas y CD4 positivas. Después de 10 días de cultivo ex vivo, se observó que las poblaciones de memoria de células madre se conservaban.
