Para comenzar, use fórceps para eliminar la grasa y el tejido conectivo de la glándula salival submandibular disecada de un ratón sacrificado. A continuación, coloque la glándula en un tubo de recolección con una solución helada de HBSS. A continuación, use fórceps para cortar la glándula en trozos cuadrados de un centímetro.
Calentar 4% de agarosa a 50 grados centígrados y verter la solución en un plato de 35 milímetros. Vierta una pequeña cantidad de la solución de agarosa en un plato aparte y agregue los trozos de glándula. Luego agite las piezas en el exceso de agarosa para cubrirlo.
A continuación, coloque de cuatro a seis trozos de la glándula plana en el primer plato con agarosa. Coloque la tapa en el plato y transfiéralo a una caja de hielo, cubriendo el plato con hielo para que se enfríe y cuaje. Para seccionar las piezas de la glándula, primero, use un bisturí para cortar con cuidado alrededor del bloque de agarosa incrustado en la glándula.
A continuación, aplique una gota de superpegamento al bloque de agarosa y fíjelo a la etapa de un vibrátomo. Ahora llene la cámara del vibrátomo con PBS helado que contenga estreptomicina al 1% de penicilina. Con un bisturí, recorta el exceso de agarosa y crea espacios de cinco milímetros entre cada pieza de glándula.
Alinee la cuchilla del vibrátomo con el bloque de agarosa y establezca los puntos de inicio y fin de las secciones. Corta el bloque de tejido en secciones de 150 micrómetros de grosor a baja velocidad y alta vibración. Una vez que se hayan cortado las secciones, use un pincel para recoger las rodajas y colóquelas en un plato con medios RPMI precalentados que contengan los antibióticos.
Para cultivar las rodajas submandibulares, primero agregue 1,5 mililitros de medio RPMI a los pocillos de una placa de seis pocillos. Coloque filtros de 0,4 micrómetros en los pocillos. A continuación, con la ayuda de un pincel, transfiera con cuidado de una a seis rodajas a cada filtro.
A continuación, incubar la placa a 37 grados centígrados bajo un 5% de dióxido de carbono. Después de irradiar algunas placas experimentales con radiación gamma para inducir lesiones, devuelva las placas a la incubadora. A continuación, llene los pocillos de una placa de 24 pocillos con 500 microlitros de medios de cultivo.
Con un pincel, levante las rodajas del filtro y sumérjalas suavemente en los pocillos. Incubar las rodajas en las manchas nucleares pertinentes. A continuación, incubar las rodajas con anticuerpos durante dos horas a 37 grados centígrados bajo una suave agitación.
Sumerja las rodajas en medios de cultivo tres veces para lavarlas. Deje que las rodajas se incuben en cada solución de lavado durante 10 minutos a temperatura ambiente bajo una agitación suave. A continuación, use fórceps para quitar la cinta de un espaciador de imágenes de doble cara.
Pegue el espaciador al fondo de una placa de seis pocillos con fondo de vidrio, luego pipetee 50 microlitros de medio en el espacio en el centro del espaciador. Coloque la rebanada en el medio asegurándose de que quede plana. Luego, con una pipeta, retire con cuidado 20 microlitros del medio del espacio.
Use pinzas para quitar con cuidado la cinta de la parte superior del espaciador y coloque un cubreobjetos circular de 25 milímetros sobre él. Presione alrededor de los bordes del espaciador para asegurar una fijación firme del cubreobjetos. Visualice el corte en un microscopio confocal.
Los cortes no irradiados de la glándula submandibular cultivados durante siete días conservaron su señal MT y su arquitectura epitelial. Sin embargo, a los tres días después de la irradiación, se observó atrofia de células acinares y ductales. Se observaron células positivas para caspasas a los cuatro días después de la irradiación.
Se observó un elevado nivel de gamma H2AX en cortes irradiados, lo que indica daño in vivo en el ADN. Las imágenes en tiempo real de los macrófagos confirmaron la fagocitosis de las células epiteliales en el modelo de cultivo de cortes. Las células individuales se pueden detectar y segmentar para el análisis posterior del comportamiento celular, como la migración.
