Para comenzar, tome cultivos de Pseudomonas aeruginosa cultivados durante 24 horas. A continuación, ajuste su densidad óptica de 600 nanómetros a 0,2 y realice diluciones adecuadas con solución salina al 0,8%. Con un asa de alambre estéril, raye el cultivo bacteriano en la placa de agar CAS.
Incubar la placa de agar CAS a 30 grados centígrados durante 24 horas. Transfiera el cultivo a una placa de microtitulación de 96 pocillos y mida la densidad óptica a 600 nanómetros. A continuación, transfiera los cultivos a tubos de centrífuga.
Centrifugar el cultivo bacteriano a 4650 g durante 10 minutos a temperatura ambiente. Pipetee 100 microlitros del sobrenadante libre de células y agréguelo a un pocillo de una placa de 96 pocillos. Luego agregue 100 microlitros de tinte CAS al pocillo.
Cubra la placa con papel de aluminio antes de la incubación. Después de la incubación, tome lecturas espectrofotométricas a 630 nanómetros y calcule la cantidad total de sideróforos como porcentaje de unidad siderófora. Pipetear 100 microlitros del sobrenadante libre de células en una placa de microtitulación de 96 pocillos.
Luego agréguele 100 microlitros de ácido triclorhídrico. Mida la lectura espectrofotométrica de la solución a 405 nanómetros. Para la extracción de piochelina, primero pipetee 100 mililitros de cultivos cultivados de Pseudomonas aeruginosa durante 48 horas en tubos de centrífuga.
Centrifugar los cultivos a 4650 g durante 10 minutos a temperatura ambiente. A continuación, agregue cinco mililitros de ácido cítrico molar al sobrenadante. Agregue 50 mililitros de acetato de etilo a la solución para extraer piochelin.
Filtrar la fase orgánica con sulfato de magnesio a través de un filtro de jeringa. A continuación, almacene la fase orgánica a menos 20 grados centígrados. Por último, tome lecturas espectrofotométricas a 320 nanómetros.
Los tres aislados clínicos y la cepa de referencia, PAO1, desarrollaron un halo naranja claro cuando se cultivaron en agar CAS, lo que indica la producción de sideróforos. Se observaron diferencias significativas entre la producción total de sideróforos del aislado J3 y la PAO1. Los análisis espectrofotométricos del extracto de pioverdina presentaron un pico confirmatorio a 380 nanómetros.
Si bien todos los aislados fueron positivos para la producción de pioverdina, MR1 y J3 mostraron una menor producción en relación con la cepa de referencia. La presencia de piochelin fue confirmada por un pico a 320 nanómetros. Los tres aislamientos clínicos produjeron volúmenes significativamente mayores en comparación con PAO1.
