Prepare moldes de inclusión creando láminas cilíndricas de estaño para cada muestra. Llene los moldes con temperatura óptima de corte o compuesto OCTA. Luego prepare dos barriles de aislamiento.
Llene el barril pequeño con isopentano y el barril grande con nitrógeno líquido. Coloque el barril pequeño dentro del más grande 10 minutos antes de la disección muscular. Comience preparando el ratón para la disección.
Corta la piel de la cara del ratón para exponer el músculo masetero. Retire las glándulas parótidas para exponer completamente la parte posterior del músculo masetero. Diseccionar el músculo masetero desde su inserción anterior hasta su inserción posterior en la mandíbula.
A continuación, sumerja el tejido muscular en OCT, manteniéndolo perpendicular al compuesto. Transfiera el molde al isopentano preenfriado con un soporte para agujas. Espere 40 segundos hasta que la OCT se vuelva blanca y sólida.
Guarde las muestras de músculo fresco congelado en placas etiquetadas de 24 pocillos. Separe las muestras inmediatamente a 20 grados centígrados o guárdelas a 80 grados centígrados para su uso a largo plazo. A continuación, corte la piel desde el tobillo hasta la rodilla y retire la fascia para exponer el músculo tibial anterior.
Use la punta de las pinzas de microdisección para aislar el tendón del tibial anterior y deslícelo hasta la rodilla para romper las fibras que se unen a la tibia. Corta el tendón a la altura del tobillo. La HE y la tinción en rojo sirio revelaron que, tras la lesión por congelación, el músculo tibial anterior mostró una regeneración completa después de 14 días con una morfología similar a la del control intacto.
Por el contrario, el músculo masetero mostró una regeneración deteriorada de las miofibras y una deposición excesiva de la matriz extracelular después de 14 días de lesión por congelación. La tinción inmunohistológica para Pax7 después de 14 días de lesión mostró núcleos densamente poblados, pero sin un aumento proporcional de las células satélite musculares. Se detectó un gran número de miofibras localizadas en el centro del músculo tibial anterior a los 14 días después de la lesión, mientras que el contorno de las miofibras apenas se notaba en el músculo masetero de la zona lesionada.
En cambio, se observó la infiltración de FAPs positivos para PDGFRalfa.
