Para comenzar, transforme las rayas en el cultivo celular de Agrobacterium tumefaciens en placas de agar manitol de levadura suplementadas con antibióticos selectivos. Incube las placas durante la noche a 28 grados centígrados en una incubadora de pie. Al día siguiente, inocular las colonias del cultivo en 12,5 mililitros de mezcla de caldo de Levadura Manitol Luria-Bertani, e incubar en un agitador orbital a 28 grados centígrados durante 16 horas a 250 RPM.
Inocular 12,5 mililitros de la cepa Agrobacterium LBA4404 en 112,5 mililitros de caldo de manitol de levadura con antibióticos. Incubar el cultivo en un agitador orbital a 28 grados centígrados durante 16 horas a 250 RPM. Ajuste el cultivo durante la noche a una densidad óptica de 0,4 con el caldo de cultivo.
Luego agregue 20 micromolares de acetosiringona antes de la incubación. Una vez que el cultivo incubado alcanza una densidad óptica de uno, centrifugar para granular las células. Vuelva a suspender el gránulo en solución de suspensión hasta una densidad óptica de 0,6 y agregue 200 micromolares de acetosiringona antes de la incubación.
Para la agroinfiltración, elija plantas leñosas de cacao que tengan ramas con hojas. Añadir 250 micromolares de ácido jasmónico a la suspensión de Agrobacterium. A continuación, configure un desecador con un vacuómetro como cámara de vacío para medir la presión en el interior.
Coloque un anillo de salto para permitir el paso de la rama de la planta. Coloque el vaso de precipitados con cultivo de Agrobacterium dentro del desecador, y coloque la rama entre el desecador y su tapa, con las hojas deseadas sumergidas en el cultivo de Agrobacterium. A continuación, utilice material de impresión de silicona para sellar los espacios entre el anillo de salto, la rama de la planta y el desecador.
Una vez que el material de silicona se haya polimerizado, cierre el desecador, sin dejar espacios, luego conéctelo a la bomba de vacío. Ponga en marcha la bomba de vacío hasta que alcance menos 0,07 megapascales. Cuando se alcance la presión deseada, cierre la válvula de presión y apague la bomba para mantener la presión durante cinco minutos.
Abra la válvula de presión de forma gradual y constante para restablecer la presión de la cámara. Después de repetir la infiltración dos veces más, retire la rama de la suspensión celular. Limpie las hojas infiltradas con agua destilada, luego coloque las plantas a 25 grados centígrados en la oscuridad durante 48 horas.
Después de la incubación, exponga el tejido infiltrado a un fotoperíodo de 16 horas de luz y ocho horas de oscuridad. Las hojas infiltradas de las plantas aparecen más oscuras en ciertas partes, lo que indica la penetración de Agrobacterium. El sistema reportero utilizado produjo una acumulación de betalaína en las hojas, que se puede observar fácilmente como pigmentación roja brillante a simple vista.
Se observó que la acumulación de betalaína variaba con la viabilidad del tejido.
