Para comenzar, descongele las muestras de plasma sanguíneo aisladas a 37 grados centígrados. Transfiera 100 microlitros de cada muestra de plasma a tubos de 1,5 mililitros. Agregue un mililitro de tampón HBSA libre de calcio a cada tubo.
Centrifugar las muestras a 20.000 g durante 15 minutos a cuatro grados centígrados. Aspirar el sobrenadante a 20 microlitros sin alterar el pellet. A continuación, agregue un mililitro del tampón HBSA libre de calcio a cada tubo.
A continuación, pipetee hacia arriba y hacia abajo para reconstituir el gránulo. Agite cada tubo durante unos segundos para asegurar una distribución equitativa de las vesículas extracelulares. A continuación, centrifugar a 20.000 g durante 15 minutos a cuatro grados centígrados.
De nuevo, aspire el sobrenadante a 20 microlitros sin alterar el pellet. A continuación, reconstituya el gránulo en 80 microlitros de tampón HBSA libre de calcio. Pipetear la suspensión hacia arriba y hacia abajo para obtener una suspensión uniforme.
Para medir la actividad del factor tisular de la vesícula extracelular, primero pipetee 40 microlitros de la muestra de vesícula extracelular en dos pocillos de una placa de 96 pocillos. En el primer pocillo, agregue 11 microlitros de una IgG inhibidora de TF anti-humano de ratón. Al otro pocillo, agregue 11 microlitros de IgG de ratón de control.
Después de la incubación, agregue 50 microlitros de la solución de mezcla de factores en cada pocillo. Cubra la placa con una película, luego incube la placa durante dos horas a 37 grados centígrados. Agregue 25 microlitros de tampón HBSA EDTA para detener la generación del factor Xa.
Reconstituir el sustrato cromogénico en agua destilada hasta una concentración de cuatro milimoles. Ahora agregue 25 microlitros del sustrato cromogénico en cada pocillo. Cubra el plato con film y luego envuélvalo en papel de aluminio.
Incubar la placa a 37 grados centígrados durante 15 minutos. A continuación, centrifuga la placa a 1.500 g durante un minuto para eliminar las burbujas. A continuación, coloque la placa en un lector de placas a 405 nanómetros.
Utilice la curva estándar generada con factor tisular recombinante relipidado para convertir la generación del factor Xa de cada pocillo. A continuación, calcule la generación del factor Xa dependiente del factor tisular. Seis de cada 11 donantes respondieron a lipopolisacáridos de media a alta, mientras que cinco de los 11 donantes respondieron a lipopolisacáridos de forma baja.
