Después de 27 días de iniciar la diferenciación hepática de las células madre pluripotentes inducidas humanas, lavar las células con dos mililitros de PBS por pocillo. Prepare la solución enzimática en el tampón ADS utilizando los componentes dados. Agregue un mililitro de solución por pocillo de una placa de seis pocillos.
Coloque la placa a 37 grados centígrados en un agitador giratorio durante unas dos horas para separar las células de la placa. Confirme el desprendimiento celular bajo un microscopio, luego pipetee la suspensión celular para dispersarla en células individuales y recójalas en un tubo de 50 mililitros que contiene el medio de maduración de los hepatocitos. Centrifugar la suspensión celular a 200 G durante cinco minutos a 18 grados centígrados.
Y con un aspirador, retire el sobrenadante. Para teñir las mitocondrias de las células, vuelva a suspender el pellet en cinco mililitros de medio de maduración de hepatocitos que contenga 100 nanomolares TMRM. Incuba las células durante 30 minutos a 37 grados centígrados mientras las proteges de la luz.
Nuevamente, centrifugue la suspensión celular y vuelva a suspender el pellet en uno a cinco mililitros de tampón ADS frío que contenga 2% de FBS. Después del recuento de células, alícuota 500.000 células a un tubo de 1,5 mililitros y etiquételo como el control de anticuerpos no primarios. Centrifugar la suspensión celular restante a 200 G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados y eliminar el sobrenadante.
Añadir 100 microlitros de anticuerpo primario diluido por cada millón de células. Transfiera la suspensión celular a un tubo de 1,5 mililitros e incube en hielo durante 50 minutos. Después de la incubación, centrifugar la suspensión celular y lavar las células dos veces con tampón ADS frío que contenga 2% de FBS.
Ahora agregue 100 microlitros de anticuerpo secundario diluido por cada millón de células al anticuerpo primario, células teñidas o no teñidas, e incube durante 30 minutos en hielo. Nuevamente, centrifugue la suspensión celular y lave las celdas dos veces con tampón ADS frío que contenga 2% de FBS. Después de resuspender las células en el tampón ADS, fíltralas a través de un colador de células de tapa a presión y coloca el tubo en hielo.
