Clasificación celular activada por fluorescencia de hepatocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas humanas

Para comenzar, configure la máquina de clasificación de células activada por fluorescencia, o FACS, para la clasificación de células siguiendo las instrucciones del fabricante. Coloque el tubo de muestra en la máquina FACS y cárguelo. Detecte la población alta de TMRM y ALCAM negativa en la región P1 para clasificar los no hepatocitos.

A continuación, se compuerta la población alta de TMRM y ALCAM positiva en la región P2 para clasificar los hepatocitos. Recoja las células clasificadas en tubos de recolección de 15 mililitros que contengan medio de maduración de hepatocitos. Después de clasificar, retire el tubo de recolección de la máquina FACS.

Centrifugar la suspensión de la célula clasificada a 200 G durante cinco minutos a 18 grados centígrados. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en dos mililitros de medio de maduración de hepatocitos con 10 inhibidores de rocas micromolares y ciclosporina A de 20 nanomolares. Siembre las células en fibroblastos embrionarios de ratón tratados con mitomicina C con medio de maduración de hepatocitos en una placa de seis pocillos. Cultive las células en una incubadora de dióxido de carbono a 37 grados centígrados durante cinco días antes de la inmunotinción para la prueba de pureza de los hepatocitos.

El análisis de FACS realizado el día 27 de la diferenciación hepática reveló una población con TMRM alta y ALCAM positiva. Se muestra la tinción inmunohistoquímica de células P1 y P2 cultivadas en fibroblastos embrionarios de ratón después de la clasificación. Una prueba de pureza mediante el recuento de células positivas para albúmina mostró 0% de P1, y aproximadamente el 97% de las células P2 eran células similares a los hepatocitos.