Comience por mantener las células TMPRSS2 HEK-293T ACE2 en DMEM que contienen FBS activado calentado, penicilina y estreptomicina en un matraz T75. Para el recuento de células, mezcle 20 microlitros de suspensión celular con 20 microlitros de solución de azul de tripano. Agregue 20 microlitros de suspensión celular mezclada con colorante a la cámara de conteo celular y cuente el número de células por mililitro.
Siembre 2,5 veces 10 elevado a la potencia de cuatro células de TMPRSS2 HEK-293T ACE2 en 50 microlitros de medio DMEM completo en cada pocillo de una placa de 96 pocillos. Incubar las células en una incubadora de dióxido de carbono durante la noche a 37 grados centígrados. Al día siguiente, reemplace los 50 microlitros de DMEM con 50 microlitros de suspensión de virus e incube durante 18 horas a 37 grados centígrados.
Después de la incubación, agregue 7,5 microlitros de tampón de lisis celular a cada pocillo y mezcle en un agitador orbital durante dos minutos. Una vez lisadas las células, agregue la solución de ensayo de luciferasa de luciferasa de luciérnaga recién preparada y mézclelas en un agitador orbital durante un minuto. Analice la actividad de la luciferasa utilizando un lector comercial de microplacas de luciferasa.
Para el ensayo de anticuerpos neutralizantes, siembre células HEK-293T en 50 microlitros de DMEM completo como se demostró anteriormente. En una placa de 96 pocillos, agregue ocho microlitros de anticuerpo neutralizante de 27 BV y realice diluciones seriadas con seis microlitros de DMEM sin suero. Agregue 54 microlitros de partícula del virus Ha-CoV-2 al anticuerpo diluido en serie y mezcle la suspensión.
Incubar durante una hora a 37 grados centígrados en dióxido de carbono al 5%. A continuación, agregue 50 microlitros de suspensión de virus a los pocillos que contienen células HEK-293T. Para los controles, agregue 50 microlitros de medio DMEM completo en los pocillos que contengan solo células HEK-293T.
Coloque la placa en una incubadora a 37 grados centígrados durante 18 horas. Después de lisar las células como se demostró anteriormente, agregue la solución de ensayo de luciferasa de luciferasa de luciérnaga recién preparada y mezcle agitando orbitalmente durante un minuto. Analice la actividad de la luciferasa utilizando un lector comercial de microplacas de luciferasa.
Las variantes Ha-CoV-2 Ómicron y Ómicron generaron de cuatro a diez veces más señal que el Ha-CoV-2 de tipo salvaje, lo que sugiere una mayor infectividad. El anticuerpo 27 BV demostró actividad neutralizante contra las variantes Delta y Ómicron. El ID50 de 27 BV para Ómicron fue aproximadamente 10 veces menos potente que el ID50 para Wild-type y Delta.
