Comience volviendo a suspender el péptido MOG 35 55 liofilizado en agua. Diluya el caldo de péptidos a 10 microgramos por mililitro en tampón de recubrimiento antes del experimento. Ahora pipetee 100 microlitros de la solución final en pocillos de una placa de 96 pocillos.
Cubra simultáneamente un número igual de pocillos con 100 microlitros de BSA disueltos en tampón de recubrimiento. Selle la placa con una película adhesiva para evitar la evaporación e incube la placa durante la noche a cuatro grados centígrados. Al día siguiente, realice tres lavados de la placa con 200 microlitros de PBS suplementado con 0,5%tween 20.
Posteriormente añadir 100 microlitros por pocillo de una solución de bloqueo compuesta por un 3%BSA en PBS. Incubar la placa sellada durante una hora a 37 grados centígrados en un horno de hibridación. Después de la incubación, lave la placa tres veces con 200 microlitros por pocillo de PBST.
Diluir cada muestra de suero obtenida de la sangre de ratones inmunizados con EAE en solución bloqueante y añadir 100 microlitros por pocillo tanto a los pocillos MOG 35 55 como a los pocillos recubiertos de BSA. Agregue el mismo volumen de solución de bloqueo a los pozos en blanco designados. Incubar la placa sellada durante dos horas a temperatura ambiente con agitación constante.
Después de la incubación, retire la placa de la incubadora y enjuague la placa tres veces con 200 microlitros por pocillo de PBST. Diluir el anticuerpo secundario conjugado HRP en una solución que contenga 0,2% de BSA en PBST y añadir 100 microlitros a cada pocillo. Incubar la placa sellada durante una hora a temperatura ambiente, manteniendo una agitación constante.
Lave el plato tres veces con 200 microlitros por pocillo de PBST. Agregue 100 microlitros de sustrato de tetrametil bencidina de tres, tres primos, cinco, cinco primos a cada pocillo. Incubar en la oscuridad durante uno a cinco minutos, monitoreando el desarrollo de un color azul.
Agregue 100 microlitros de solución de parada a cada pocillo. A continuación, utilice un lector de placas configurado a una longitud de onda de 450 nanómetros para medir la densidad óptica de cada pocillo. Los valores de densidad óptica de las muestras de EAE fueron significativamente más altos que los de las muestras de control, lo que indica una respuesta robusta de inmunoglobulina G contra el péptido MOG.
