Para comenzar, prepare una solución intravenosa de colágeno de un miligramo por mililitro en agua y agregue 95 microlitros de esta solución a cada pocillo de un portaobjetos de cámara inferior de imágenes de 10 pocillos. Incube el portaobjetos a 37 grados centígrados durante 30 minutos a dos horas para cubrir los pocillos. De los organoides intestinales humanos cultivados en 3D, retire el medio de mantenimiento WRNE de los pocillos de cinco a siete días después del último paso.
A continuación, añada 500 microlitros de 1xPBS que contengan 0,5 milimolares de EDTA por pocillo. Con una punta precodificada de un mililitro, pipetee suavemente para separar el BMM de la placa. Transfiera la suspensión a un tubo cónico precodificado de 15 mililitros.
Enjuague cada pocillo con 500 microlitros adicionales de la solución PBS EDTA. Centrifugar la suspensión y eliminar el sobrenadante y el BMM residual. Luego, use una punta precodificada para resuspender el gránulo en tres mililitros de PBS que contienen cinco milimolares de EDTA.
Centrifugar de nuevo y resuspender en dos mililitros de tampón de disociación enzimática. Incuba el tubo a 37 grados centígrados durante cinco minutos. Luego, agregue tres mililitros de CMGF con 10% de FBS y mezcle suavemente.
Centrifugar y agregar un mililitro de CMGF al pellet. Pipetear vigorosamente la mezcla de 80 a 100 veces para romper los organoides en células individuales. Centrifugar y resuspender el pellet en un mililitro de medio WRNE.
Obtener un recuento celular y diluir la suspensión celular para lograr 1,25 por 10 a las cinco células en 100 microlitros. A continuación, retira la solución de colágeno de la placa previamente preparada, evitando tocar el fondo del pocillo. Luego agregue 100 microlitros de la solución celular preparada por pocillo.
Incubar durante 24 horas en una incubadora de cultivos celulares a 37 grados centígrados. Reemplace el medio con 100 mililitros de medio de diferenciación por pocillo cada 24 horas hasta la confluencia. Después de este punto, las monocapas están listas para aplicaciones posteriores.
