Para comenzar, esterilice y diseccione los ojos enucleados obtenidos de una carnicería inspeccionada por el USDA, para preparar la copa del ojo. Coloque suavemente la copa del ojo, con el interior hacia arriba, en la placa de Petri que contiene el filtro de células. Agregue DPBS enfriado a la copa del ojo, asegurándose de que el nivel de líquido esté justo por debajo del punto más bajo de la incisión.
Bajo una linterna, busque cualquier área donde la retina neural esté comenzando a desprenderse del epitelio pigmentario de la retina, luego use pinzas romas para agarrar suavemente la retina neural levantada y despegarla. Recoja suavemente la retina neural cerca del disco óptico. Con una pipeta de pasto conectada a un sistema de aspiración endouterina, aspire la retina neural.
Agregue con cuidado DPBS refrigerados adicionales para reemplazar el volumen aspirado. Ahora, aspire este DPBS agregado para eliminar cualquier retina neural restante. Después de quitar la retina neural de todas las copas oculares, agregue suavemente tripsina a cada copa ocular y vuelva a colocar la tapa de la placa de Petri.
Incubar los ojos con tripsina a 37 grados centígrados con dióxido de carbono al 5% durante 30 minutos. Bajo una linterna, use una pipeta de mil microlitros para desalojar suavemente las células del epitelio pigmentario de la retina de cada copa del ojo. Transfiera las células desprendidas a un tubo de centrífuga de 15 mililitros.
Lave el ocular con medios de cultivo celular para recoger las células restantes, así como para neutralizar la tripsina. Mezcle estas células que contienen medios con las células recogidas previamente. Centrifugar la suspensión celular a 250 G durante cinco minutos a temperatura ambiente.
A continuación, retire el sobrenadante sin alterar el gránulo celular. Vuelva a suspender cada gránulo celular en tres mililitros de solución de trabajo de D anasa. Incubar la suspensión celular a 37 grados centígrados con dióxido de carbono al 5% durante 15 minutos.
Luego, centrifugérelo a 150 G durante cinco minutos a temperatura ambiente. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el gránulo celular en tres mililitros de medios de cultivo celular frescos. Transfiera las células obtenidas de dos o tres ojos en un pocillo de una placa de seis pocillos y considérese esto como pasaje cero.
Luego, transfiera con cuidado la placa de seis pocillos sembrada a una incubadora humidificada a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Se aislaron células primarias del epitelio pigmentario de la retina de ojos porcinos con pigmentación característica evidente tres días después del aislamiento. Las células alcanzaron la confluencia completa después de una semana, lo que indica una monocapa sana.
Los cultivos que presentaban una morfología anormal y una pigmentación excesiva se reconocieron como contaminados y no se utilizaron en los experimentos.
