Los autores desean agradecer a Farhad Farjood por su ayuda con el cultivo y aislamiento de células de EPR porcino y a Thomas Harris por su ayuda con SEM. Los autores agradecen el apoyo de la Instalación Central de Microscopía de la Universidad Estatal de Utah para el análisis SEM. La instalación mantiene un microscopio electrónico de barrido adquirido a través de una subvención de instrumentación de investigación principal de la Fundación Nacional de Ciencias (CMMI-1337932). La financiación de este estudio fue proporcionada por los Institutos Nacionales de Salud a través de la subvención 1R15EY028732 (Vargis) y una subvención de la Fundación BrightFocus M2019109 (Vargis). Se proporcionaron fondos adicionales mediante una beca de investigación de pregrado y oportunidades creativas (Weatherston) de la Oficina de Investigación de la Universidad Estatal de Utah y una subvención inicial (Vargis) del Centro de Investigación de la Enfermedad de Alzheimer y la Demencia de la Universidad Estatal de Utah.

Los ojos utilizados en este procedimiento se obtienen post mortem de una carnicería local inspeccionada por el USDA, y no se realiza ningún trabajo con animales vivos. Después de que los animales han sido sacrificados, pasan aproximadamente 2 horas antes de que los ojos sean enucleados. Dado que puede comenzar a producirse una caries en los tejidos, es importante mantener los ojos fríos durante el transporte para evitar más caries. En este procedimiento, los ojos se colocan inmediatamente en un refrigerador después de la enucleación. Posteriormente, la bolsa de ojos se coloca dentro de un vaso de polipropileno de 1000 mL y se rodea de hielo dentro de un enfriador de 8 L. Es importante no colocar los ojos directamente sobre el hielo. Una vez que los ojos llegan al laboratorio, el aislamiento de las células del EPR se realiza dentro de una cabina de bioseguridad. Es crucial completar este proceso en un plazo de 3 a 5 horas. Este protocolo ha sido optimizado para procesar 10 ojos.
1. Preparación de las alícuotas de las existencias de DNasa
NOTA: Se recomienda que este paso se realice antes del aislamiento.
<ol><li>Prepare una solución de cloruro de calcio de 5 mM con agua desionizada estéril. PRECAUCIÓN: El cloruro de calcio en polvo puede causar irritación o daño ocular grave. Use el equipo de protección personal adecuado.</li>
	<li>Agregue 5 mM de solución de cloruro de calcio al polvo de DNasa (ver Tabla de Materiales) para obtener una concentración final de DNasa de 3 mg/mL. Asegúrese de que la solución esté bien mezclada. PRECAUCIÓN: La DNasa es un peligro para la sensibilización respiratoria. No inhale polvo/sustancia.</li>
	<li>Alícuota de pequeños volúmenes, por ejemplo 1 mL, en tubos de microcentrífuga.</li>
	<li>Congelar las alícuotas a -20 °C hasta su uso.</li>
</ol>2. Configuración del área de disección
<ol><li>Transfiera los instrumentos de disección estériles y el equipo de cultivo celular al gabinete de bioseguridad: paño quirúrgico, placas de Petri, filtros de células, placas de pocillos, gasas, pinzas, mango de bisturí, hoja de bisturí y tijeras de iris (consulte la Tabla de materiales).</li>
	<li>Con unas pinzas, coloque el paño quirúrgico. Coloque una placa de 6 pocillos sobre el paño quirúrgico y retire la tapa.</li>
	<li>Coloque una alícuota de solución salina tamponada con fosfato (DPBS) estéril de Dulbecco sobre hielo y en el gabinete de bioseguridad.</li>
	<li>Llene un pocillo de un plato de 6 pocillos hasta la mitad (aproximadamente 6 ml) de solución de povidona yodada al 10%.</li>
	<li>Llene los pocillos restantes con DPBS refrigerado.</li>
	<li>Retire la tapa de una de las placas de Petri y colóquela, invertida, sobre el paño quirúrgico. Reserve la base de la placa de Petri como contenedor de residuos.</li>
	<li>Colocar una alícuota de medios de cultivo celular (medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), suero fetal bovino (FBS) al 10%, antibióticos/antimicóticos al 1%) y una alícuota de tripsina/EDTA al 0,25% en un baño de agua a 37 °C.</li>
	<li>Retire la solución madre de DNasa del congelador (consulte el resto del protocolo para obtener más detalles).</li>
</ol>3. Extirpación del tejido exterior
NOTA: La extracción de tejido exterior se puede realizar fuera de la cabina de bioseguridad. Inspeccione el ojo antes de cortar para asegurarse de que la esclerótica no haya sido perforada, que la pupila no esté nublada y que el nervio óptico esté presente. Deseche los ojos que no cumplan con estos criterios.
<ol><li>Mientras sostiene el músculo unido al ojo con una mano, use la otra mano para cortar suavemente el tejido que rodea la esclerótica con un bisturí. Tenga cuidado de no aplastar el ojo o cortar accidentalmente la esclerótica. Si la esclerótica está cortada y expone el interior negro, deseche el ojo. PRECAUCIÓN: Se recomienda encarecidamente un guante resistente a los cortes para la mano que sostiene el músculo para protegerlo contra cortes accidentales.</li>
	<li>Recorte el nervio óptico con unas tijeras de iris curvo a una longitud no superior a 3 mm. Si el nervio óptico es demasiado largo, la copa del ojo no se asentará correctamente en el filtro celular más adelante.</li>
	<li>Coloque el ojo sobre hielo con la córnea hacia abajo.</li>
	<li>Repita los pasos 3.1-3.3 hasta que se extraiga el tejido exterior de cada ojo.</li>
</ol>4. Disección ocular
<ol><li>Use pinzas para transferir un ojo al gabinete de bioseguridad y al pocillo que contiene una solución de povidona yodada al 10% y gire el ojo para asegurarse de que esté completamente cubierto con la solución de yodo. Para mantener las herramientas lo más estériles posible, estas pinzas solo deben usarse para tocar el exterior del ojo.</li>
	<li>Mientras el ojo está en una solución de yodo, coloque una gasa estéril en la tapa invertida poco profunda de la placa de Petri preparada anteriormente. En una placa de Petri aparte, coloque un colador de células. Utilice únicamente el colador de células para sostener la copa del ojo, no para la separación de células.</li>
	<li>Después de dejar reposar el ojo en una solución de yodo durante aproximadamente 30 s, lávese el ojo sumergiéndolo en los pocillos que contienen DPBS durante aproximadamente 5 s cada uno, moviéndose de pocillo en pocillo para diluir progresivamente la solución de yodo y transfiera el ojo a la gasa estéril.</li>
	<li>Haz una pequeña incisión con un bisturí debajo de la ora serrata, o aproximadamente 1/3 del globo desde el borde del iris.</li>
	<li>Después de la incisión, use unas tijeras de iris para cortar uniformemente a lo largo de la circunferencia del globo, paralelo a la córnea. Al maniobrar el ojo, solo use las pinzas para tocar la parte exterior del ojo o la gasa para mantener la esterilidad.</li>
	<li>Use las pinzas para agarrar el nervio óptico y levante suavemente el globo de la gasa. El vítreo debe caerse del globo. Si es necesario, agite suavemente el ojo para ayudar a desalojar el vítreo. NOTA: Si el vítreo es muy difícil de eliminar, intente cortar más abajo en el globo.</li>
	<li>Coloque suavemente el ocular en el colador de células preparado, con el interior del ocular hacia arriba. Si es desigual, use pinzas para ajustar el ocular para que la incisión quede lo más nivelada posible.</li>
	<li>Agregue suavemente DPBS enfriado a la copa del ojo para que el nivel de líquido esté justo por debajo del punto más bajo de la incisión. Este DPBS se extirpará después de la extirpación de la retina neural. NOTA: El volumen de DPBS agregado variará según el tamaño del ojo y la ubicación de la incisión.</li>
	<li>Repita los pasos 4.1-4.8 hasta que se disecen todos los ojos.</li>
</ol>5. Extirpación de retina neural y disociación del EPR
NOTA: La siguiente sección es más fácil de realizar por etapas. En esta configuración, este proceso se realiza en un lote (generalmente 3 copas oculares) a la vez. Para los pasos 5.1-5.7, cada paso debe realizarse en todo el lote antes de pasar al siguiente paso.
<ol><li>Debajo de una linterna, busque cualquier área donde la retina neural (blanca/rosa) esté comenzando a desprenderse del EPR (negro). Luego, use pinzas romas para agarrar suavemente la retina neural levantada y despegarla. NOTA: Si no hay áreas donde la retina neural se esté desprendiendo, use las pinzas para agarrarla suavemente cerca de la parte superior de la copa del ojo. Con este método, si se produce daño en el EPR/coroides, esas células no se disociarán durante la recolección del EPR.</li>
	<li>Recoja suavemente la retina neural cerca del disco óptico.</li>
	<li>Aspire la retina neural con una pipeta Pasteur conectada a un sistema de aspiración endouterina. Se recomienda difuminar la aspiración para ayudar en el proceso de eliminación. NOTA: Se puede colocar una punta de pipeta en el extremo de una pipeta Pasteur para reducir la succión.</li>
	<li>Agregue con cuidado DPBS refrigerados adicionales para reemplazar lo que se aspiró.</li>
	<li>Retire la retina neural restante aspirando una vez más. Esta vez, elimine la mayor cantidad posible de DPBS sin alterar el EPR expuesto.</li>
	<li>Agregue suavemente tripsina a la copa del ojo. Mantenga el nivel de volumen por debajo de la línea de incisión y de cualquier sección de EPR dañado para reducir la contaminación. PRECAUCIÓN: La tripsina es una enzima que causará irritación de la piel y los ojos al contacto. Use el equipo de protección personal adecuado.</li>
	<li>Después de agregar tripsina a cada ojo, asegúrese de reemplazar la tapa de la placa de Petri. A continuación, transfiera la placa de Petri a una incubadora humidificada a 37 °C y 5% de CO2 durante 30 min.</li>
	<li>Repita los pasos 5.1 a 5.7 para cada lote hasta que se hayan procesado todas las copas oculares.</li>
</ol>6. Recogida de RPE
<ol><li>Recoja las células del EPR de cada lote de ojos (2-3 ojos) y colóquelas en un solo tubo de centrífuga de 15 ml para facilitar el proceso de siembra.<ol><li>Bajo una linterna, triture suavemente con una pipeta de 1000 μL para desalojar las células del EPR. Si las células del EPR no se desprenden, agregue tripsina fresca e incube durante 10-15 minutos más. Tenga cuidado de no raspar la retina.</li>
		<li>Recoja las células del EPR en un tubo de centrífuga de 15 ml.</li>
		<li>Lave la copa ocular con medios de cultivo celular para recolectar las células restantes y neutralizar la tripsina. Asegúrese de que haya al menos el doble de volumen de medios para tripsina en el tubo de centrífuga de 15 ml.</li>
	</ol></li>
	<li>Repita el paso 6.1 hasta que se hayan recolectado células del EPR de todas las copas oculares.</li>
	<li>Centrifugar las suspensiones celulares a 250 x g durante 5 min a temperatura ambiente.</li>
</ol>7. Preparación de la solución de trabajo de DNase
<ol><li>Calcule el volumen de 3 mg/ml de solución madre de DNasa (preparada en el paso 1) necesario para añadir a los medios de cultivo celular para obtener una concentración final de 100 μg/ml y un volumen final de 3 ml por tubo de células (es decir, para tres tubos centrífugos de células, se requieren 9 ml de solución de DNasa de 100 μg/ml).</li>
	<li>Combine los volúmenes apropiados de solución madre de DNasa y medios de cultivo celular. El uso de DNasa en la solución de trabajo ayuda a prevenir la aglomeración celular y permite que las células se siembren de manera uniforme.</li>
</ol>8. Siembra de células EPR
<ol><li>Después de la centrifugación en el paso 6.3, retire los sobrenadantes de cada tubo de centrífuga de 15 ml, con cuidado de no romper el gránulo celular.</li>
	<li>Vuelva a suspender cada gránulo celular en 3 ml de solución de trabajo de DNasa.</li>
	<li>Colocar los tubos de centrífuga de 15 mL que contienen las células resuspendidas en una incubadora humidificada a 37 °C y 5% de CO2 durante 15 min.</li>
	<li>Después de la incubación, centrifugar las suspensiones celulares a 150 x g durante 5 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Retire los sobrenadantes, con cuidado de no alterar los gránulos de la celda.</li>
	<li>Vuelva a suspender cada gránulo celular en 3 ml de medio de cultivo celular fresco.</li>
	<li>Para cada tubo de centrífuga que contenga 2-3 ojos de células EPR, siembre un pocillo de una placa de 6 pocillos (pasaje 0).</li>
	<li>Con cuidado, transfiera la placa de 6 pocillos sembrada a una incubadora humidificada a 37 °C y 5% deCO2.</li>
</ol>9. Cultivo primario de células EPR porcinas
<ol><li>Deje que las células del EPR recién sembradas se adhieran durante 48-72 h antes de mover la placa. Durante el primer cambio de medio, se puede realizar un lavado con medios de cultivo celular nuevos para ayudar a eliminar el exceso de restos celulares.</li>
	<li>Reemplace el medio de cultivo celular cada 48 h.</li>
	<li>Cuando las células alcancen la confluencia, se debe hacer la transición a un medio de cultivo celular con una concentración de FBS del 2% y mantener hasta la experimentación.</li>
</ol>10. Validación de la célula RPE
<ol><li>Tinción inmunocitoquímica (ICC)<ol><li>Fije las celdas en formaldehído al 4% en DPBS durante 10 minutos a temperatura ambiente.</li>
		<li>Lavar dos veces con DPBS.</li>
		<li>Permeabilice las células (si es necesario) con Triton-X 100 al 0,2 % en DPBS durante 10 minutos a temperatura ambiente.</li>
		<li>Lavar dos veces con DPBS.</li>
		<li>Aplique una solución de bloqueo de albúmina sérica bovina (BSA) al 3% (p/v) en DPBS durante 1 h a temperatura ambiente.</li>
		<li>Añadir el anticuerpo primario a una dilución de 1:100 (o a la concentración recomendada por el fabricante) (ver Tabla de materiales) y dejar reposar durante 1 h a temperatura ambiente o toda la noche a 4 °C.</li>
		<li>Lavar tres veces con DPBS durante 5 minutos cada una.</li>
		<li>Agregue el anticuerpo secundario (si es necesario) a 2 μg/ml (o la concentración recomendada por el fabricante) (consulte la Tabla de materiales) y deje reposar durante 1 h a temperatura ambiente.</li>
		<li>Lavar tres veces con DPBS durante 5 minutos cada una si se aplica un anticuerpo secundario.</li>
		<li>Agregue la sonda de tinción nuclear a la concentración del fabricante (consulte la Tabla de materiales) y déjela reposar durante 25 minutos a temperatura ambiente.</li>
		<li>Lavar tres veces con PBS durante 5 minutos cada una.</li>
		<li>Si se encuentra en un inserto de cultivo celular, móntelo en el portaobjetos del microscopio con un cubreobjetos utilizando el medio de montaje descrito por Rickabaugh y Weatherston et al.20. De lo contrario, las celdas de imagen en DPBS.</li>
	</ol></li>
	<li>Microscopía electrónica de barrido (SEM)<ol><li>Seguir el procedimiento descrito por Harris et al.21.</li>
	</ol></li>
	<li>Resistencia eléctrica transepitelial (TEER)<ol><li>Siga el protocolo del fabricante para la medición de TEER (ver Tabla de Materiales) con 1 mL de medio de cultivo en la cámara basal15.</li>
	</ol></li>
	<li>Ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA)<ol><li>Realice ELISA15 utilizando un kit de ensayo de inmunoabsorción enzimática humana múltiple siguiendo el protocolo del fabricante (consulte la tabla de materiales).</li>
	</ol></li>
</ol>

Un método rentable para aislar las células primarias del EPR de los ojos porcinos

<ol>
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Este protocolo describe cómo aislar las células del EPR de los ojos porcinos. La pigmentación y la morfología de los adoquines se observan a los 7 días del aislamiento (Figura 1B). Además, los datos de TEER indican la formación de uniones estrechas22 y una monocapa saludable (Figura 5). Estos resultados muestran que las células de EPR aisladas con este método son similares a las EPR humanas y pueden ser beneficiosas en modelos de...

El epitelio pigmentario de la retina (EPR) es una monocapa situada en la retina externa entre la membrana de Bruch y los fotorreceptores1. Las células del EPR forman uniones estrechas con proteínas como la zonula occludens-1 (ZO-1) y poseen un fenotipo distintivo caracterizado por pigmentación y morfología hexagonal 2,3. Estas células contribuyen a la barrera hematorretiniana, apoyando así la salud de los fotorreceptores y manteniendo la homeostasis de la retina 4,5. Además, las células del EPR desempeñan un papel fundamental en la visión al absorber la luz y reciclar componentes esenciales para los fotorreceptores6. Por ejemplo, RPE65, una proteína altamente expresada en las células EPR, convierte los ésteres de retinol trans en retinol 11-cis 7,8. Dada la multitud de funciones que realizan las células EPR, su disfunción está implicada en diversas enfermedades, como la degeneración macular asociada a la edad y la retinopatía diabética 9,10. Para mejorar la comprensión de las patologías de la retina y desarrollar nuevos tratamientos, se emplean con frecuencia modelos in vitro de la retina.
Para generar modelos representativos de retinas sanas o enfermas, es imprescindible utilizar un tipo de célula mimética del EPR. La línea celular ARPE-19 disponible comercialmente carece de fenotipos nativos, como la pigmentación, mientras que las iPSC pueden tardar meses en diferenciarse 11,12,13. Aunque los ojos de donantes humanos pueden ser ideales, a menudo no están disponibles para muchos laboratorios de investigación.
Aquí, hemos ideado un método para utilizar ojos porcinos, que comparten muchas similitudes con los ojos humanos14, para obtener células primarias del EPR. Estas células primarias del EPR porcino se han utilizado en múltiples modelos de retina15,16. Estas células no solo son rentables, sino que también requieren menos tiempo para adquirirse que las iPSC o los ojos de donante. Además, exhiben características nativas, como pigmentación y microvellosidades. Si bien existen protocolos similares para la extracción de EPR porcino 17,18,19, esta técnica sencilla y detallada valida aún más la disociación enzimática y emplea materiales que se encuentran comúnmente en la mayoría de los laboratorios de cultivos celulares.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>6 Micro-well glass bottom plate with 14 mm micro-well #1 cover glass</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>P06-14-1-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety Cabinet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride, Dried, Powder, 97%</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>L13191.30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>22-363-548</td>
			<td>one per eye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes, 15 mL</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>05-539-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooler, 8 L</td>
			<td>Igloo</td>
			<td>32529</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polyester Membrane Inserts</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>07-200-154</td>
			<td>Culture inserts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cut Resistant Glove</td>
			<td>Dowellife</td>
			<td>712971375857</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytiva&#160;HyClone Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline, Solution</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>SH3026401</td>
			<td>for ICC dilutions only&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized Water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, 1x with 4.5 g/L glucose, L-glutamine &#38; sodium pyruvate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I from Bovine Pancreas</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>DN25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS/Modified - calcium - magnesium</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>SH3002B.02</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA kit, Q-Plex Human Angiogenesis (9-Plex)&#160;</td>
			<td>Quansys Biosciences, Logan, UT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ENDOHM 6 TEER device</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Avantor</td>
			<td>232B20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher BioReagents&#160;Bovine Serum Albumin (BSA) DNase- and Protease-free Powder</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>BP9706100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flashlight</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde, ACS Grade, 36.5% (w/w) to 38.0% (w/w), LabChem</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>LC146501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze Sponges</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>22-415-504</td>
			<td>One per eye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 647, Invitrogen</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A32728</td>
			<td>RPE65 secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Crushed prefered</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Phase Contrast Microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen&#160;NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342)</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>R37605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Fine Tip Scissors, Standard Grade, Curved, 4.5&#34;</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>EW-10818-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Scissors, 11 cm, Straight, Tungsten Carbide</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>50-822-379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM-710 Confocal Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish, 100 mm x 20 mm&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td>one per 2-3 eyes and one for dissection surface/waste&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone-Iondine Solution, 10%</td>
			<td>Equate</td>
			<td>49035-050-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPE65 Monoclonal Antibody (401.8B11.3D9), Invitrogen</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>MA116578</td>
			<td>RPE65 primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Blades Size 10</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>22-079-683</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Handles Style 3</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>50-118-4164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Drape, 18 x 26&#34;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>50-209-1792</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>37 &#176;C, 5% CO2, 95% Humidity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Plates, 6 Wells</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-892</td>
			<td>One for eye wash and one for seeding&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tri-Cornered Polypropylene Beaker, 1000 mL</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>14-955-111F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton&#160;X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.25%, 2.21 mM EDTA in HBSS; w/o Ca, Mg, Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25053Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers Style 20A</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>17-467-231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers Style 2A</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>50-238-47</td>
			<td>for removing neural retina</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers Style 5-SA-PI</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>17-467-168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Aspiration System</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath, 37 &#176;C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZO-1 Monoclonal Antibody (ZO1-1A12), FITC, Invitrogen</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>33-911-1</td>
			<td>ZO-1 conjugated primary antibody</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of primary porcine retinal pigment epithelial cells for in vitro modeling

El epitelio pigmentario de la retina (EPR) es una monocapa crucial en la retina externa responsable de soportar los fotorreceptores. La degeneración del EPR ocurre comúnmente en enfermedades marcadas por la pérdida progresiva de la visión, como la degeneración macular relacionada con la edad (DMAE). La investigación sobre la DMAE a menudo se basa en ojos de donantes humanos o células madre pluripotentes inducidas (iPSC) para representar el EPR. Sin embargo, estas fuentes de EPR requieren períodos de diferenciación prolongados y una experiencia sustancial para el cultivo. Además, algunas instituciones de investigación, en particular las de las zonas rurales, carecen de fácil acceso a los ojos de los donantes. Si bien existe una línea celular de EPR inmortalizada disponible comercialmente (ARPE-19), carece de características esenciales de EPR in vivo y no es ampliamente aceptada en muchas publicaciones de investigación oftalmológica. Existe una necesidad apremiante de obtener células primarias representativas del EPR de una fuente más fácilmente disponible y rentable. Este protocolo dilucida el aislamiento y subcultivo de células primarias de EPR obtenidas post-mortem de ojos porcinos, que pueden obtenerse localmente de proveedores comerciales o académicos. Este protocolo requiere materiales comunes que normalmente se encuentran en los laboratorios de cultivo de tejidos. El resultado es una alternativa primaria, diferenciada y rentable a las iPSC, los ojos de donantes humanos y las células ARPE-19.

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer located in the outer retina&#160;between Bruch&#39;s membrane and the photoreceptors1. RPE cells form tight junctions with proteins such as zonula occludens-1 (ZO-1) and possess a distinctive phenotype characterized by pigmentation and hexagonal morphology2,3. These cells contribute to the blood-retinal barrier, thereby supporting photoreceptor health and maintaining retinal homeostasis4,5. Additionally, RPE cells play a critical role in vision by absorbing light and recycling essential components for the photoreceptors6. For instance, RPE65, a protein highly expressed in RPE cells, converts all-trans retinyl esters to 11-cis retinol7,8. Given the multitude of functions performed by RPE cells, their dysfunction is implicated in various diseases, including age-related macular degeneration and diabetic retinopathy9,10. To enhance the understanding of retinal pathologies and develop new treatments, in vitro models of the retina are frequently employed.
To generate representative models of healthy or diseased retinas, it is imperative to use a mimetic RPE cell type. The commercially available ARPE-19 cell line lacks native phenotypes, such as pigmentation, while iPSCs can take months to differentiate11,12,13. Although human donor eyes may be ideal, they are often not readily available to many research labs.
Here, we have devised a method to utilize porcine eyes, which share many similarities with human eyes14, for obtaining primary RPE cells. These primary porcine RPE cells have been utilized in multiple retinal models15,16. Not only are these cells cost-effective, but they also require less time to acquire than iPSCs or donor eyes. Additionally, they exhibit native characteristics, such as pigmentation and microvilli. While similar protocols for porcine RPE extraction exist17,18,19, this straightforward and detailed technique further validates enzymatic dissociation and employs materials commonly found in most cell culture laboratories.

Autor destacado: Modelado de patologías de la retina con modelos mejorados de enfermedades basadas en células RPE

Aislamiento de células epiteliales pigmentarias primarias de la retina porcina para modelado in vitro

We engineer disease models to mimic aspects of retinal pathologies. With these models, we can better understand the role of RPE cells in diseases based on their response to physical changes, like when strain occurs on the monolayer or a brex membrane thickens with age. One of the biggest challenges is having a representative cell type.Compared to the commonly used immortalized cell line, the primary cells isolated with this technique make our disease models more realistic to what happens in our eyes. This technique provides us with a method of obtaining high quality cells without requiring extensive differentiation times. Furthermore, we use resources that are commonly available to research labs, which makes it more cost effective.Moving forward, we want to look at how natural changes that happen in your eyes during aging, may lead to the early stages of AMD. We want to better understand those changes so we can identify specific treatment targets.

Con este procedimiento, las células primarias del EPR se aislaron con éxito de los ojos porcinos. La Figura 1A muestra las células del EPR 3 días después del aislamiento con pigmentación característica. Después de 1 semana de crecimiento, las células fueron completamente confluentes y formaron una monocapa sana (Figura 1B). A continuación, las células se transfirieron a insertos de cultivo celular donde mantuvieron su pigmentación y morfología (<str...

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Este protocolo describe el procedimiento para obtener y cultivar células epiteliales pigmentarias primarias de la retina (EPR) a partir de ojos porcinos de origen local. Estas células sirven como una alternativa de alta calidad a las células madre y son adecuadas para la investigación in vitro de la retina.

The retinal pigment epithelium (RPE) is a crucial monolayer in the outer retina responsible for supporting photoreceptors. RPE degeneration commonly ...

Diseñamos modelos de enfermedades para imitar aspectos de las patologías de la retina. Con estos modelos, podemos comprender mejor el papel de las células EPR en las enfermedades en función de su respuesta a los cambios físicos, como cuando se produce una tensión en la monocapa o cuando una membrana brex se engrosa con la edad. Uno de los mayores desafíos es tener un tipo de célula representativo.En comparación con la línea celular inmortalizada de uso común, las células primarias aisladas con esta técnica hacen que nuestros modelos de enfermedad sean más realistas a lo que sucede en nuestros ojos. Esta técnica nos proporciona un método para obtener células de alta calidad sin requerir grandes tiempos de diferenciación. Además, utilizamos recursos que suelen estar disponibles para los laboratorios de investigación, lo que lo hace más rentable.En el futuro, queremos ver cómo los cambios naturales que ocurren en los ojos durante el envejecimiento pueden conducir a las primeras etapas de la DMAE. Queremos comprender mejor esos cambios para poder identificar objetivos de tratamiento específicos.

isolation-primary-porcine-retinal-pigment-epithelial-cells-for-vitro

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Primary Porcine Retinal Pigment Epithelial Cells for In Vitro Modeling

544 vistas.  Utah State University. Diseñamos modelos de enfermedades para imitar aspectos de las patologías de la retina. Con estos modelos, podemos comprender mejor el papel de las células EPR en las enfermedades en función de su respuesta a los cambios físicos, como cuando se produce una tensión en la monocapa o cuando una membrana brex se engrosa con la edad. Uno de los mayores desafíos es tener un tipo de célula representativo.En comparación con la línea celular inmortalizada de uso común, las células pr...

Video: Autor destacado: Modelado de patologías de la retina con modelos mejorados de enfermedades basadas en células RPE

The retinal pigment epithelium (RPE) is a crucial monolayer in the outer retina responsible for supporting photoreceptors. RPE degeneration commonly occurs in diseases marked by progressive vision loss, such as age-related macular degeneration (AMD). Research on AMD often relies on human donor eyes or induced pluripotent stem cells (iPSCs) to represent the RPE. However, these RPE sources require extended differentiation periods and substantial expertise for culturing. Additionally, some research institutions, particularly those in rural areas, lack easy access to donor eyes. While a commercially available immortalized RPE cell line (ARPE-19) exists, it lacks essential in vivo RPE features and is not widely accepted in many ophthalmology research publications. There is a pressing need to obtain representative primary RPE cells from a more readily available and cost-effective source. This protocol elucidates the isolation and subculture of primary RPE cells obtained post-mortem from porcine eyes, which can be sourced locally from commercial or academic suppliers. This protocol necessitates common materials typically found in tissue culture labs. The result is a primary, differentiated, and cost-effective alternative to iPSCs, human donor eyes, and ARPE-19 cells.

This protocol outlines the procedure for obtaining and culturing primary retinal pigment epithelial (RPE) cells from locally sourced porcine eyes. These cells serve as a high-quality alternative to stem cells and are suitable for in vitro retinal research.

Investigación

Biología

Porcine Eye Dissection to Isolate the Retinal Pigment Epithelium (RPE) Cells

Disección ocular porcina para aislar las células del epitelio pigmentario de la retina (EPR)

Neural Retina Removal and Retinal Pigment Epithelium (RPE) Cell Isolation from Porcine Eyes for In Vitro Retinal Research

Extirpación neural de la retina y aislamiento de células del epitelio pigmentario de la retina (EPR) de los ojos porcinos para la investigación in vitro de la retina