Para comenzar, disuelva dos miligramos de PEG multivalente con grupo reactivo maleimida y un mililitro de tampón fosfato de 100 milimolares. Filtre la solución a través de un filtro de 0,2 micrómetros. Agregue los conjugados peptídicos de ADN terminados en cisteína a la solución.
Utilice la cromatografía de exclusión por tamaño para eliminar los materiales no conjugados. Ejecute los ejemplos en PBS. Monitorizar la absorbancia del para detectar ADN y péptidos.
Colocar la muestra en los tubos del filtro centrífugo y concentrar los nanosensores sintetizados por centrifugación según la velocidad recomendada por el fabricante. Utilice una placa de 96 pocillos como base para una cámara de alojamiento personalizada. Para recolectar la orina para las mediciones de referencia, primero coloque un ratón en la cámara de la carcasa.
Aplique una presión suave sobre la vejiga del ratón sujeta para expulsar la orina restante en el plato. Pipetea la orina recolectada en un tubo de 1,5 mililitros. Preparar 200 microlitros de la solución inyectable del nanosensor en PBS estéril.
Inyecte por vía intravenosa 200 microlitros de la solución en cada ratón. Después de una hora de inyección, recoja las muestras de orina de los ratones de control y experimentales. Para la detección CRISPR basada en fluorescencia de los códigos de barras de ADN, centrifugar las muestras de orina a 800 G durante cinco minutos a temperatura ambiente.
Ahora combine los reactivos CRISPR, luego agregue la enzima Cas12a antes de pipetear suavemente la mezcla de reacción hacia arriba y hacia abajo. Incubar la mezcla de reacción a 37 grados centígrados durante 30 minutos. A continuación, ejecute la reacción reportera utilizando la mezcla de ADN reportero basada en FRET.
Agregue la mezcla a una placa de 384 pocillos e inmediatamente mida la fluorescencia a 37 grados Celsius cada dos minutos durante tres horas para monitorear la cinética de escisión. Para realizar la detección de CRISPR en papel, ejecute una reacción reportera alternativa después de la incubación de la reacción CRISPR utilizando un reportero de ADN marcado con FAM-Biotina. Después de combinar los reactivos en una placa de 96 pocillos, cúbrala con papel de aluminio y luego coloque la placa en una incubadora a 37 grados centígrados durante 30 minutos.
Ahora agregue 80 microlitros de PBS en un pocillo nuevo de una placa de 96 pocillos. Pipetee 20 microlitros de mezcla de reacción reportera en este pocillo. Coloque una tira de papel de flujo lateral en cada pocillo y espere hasta que el líquido llegue a la parte superior de la tira.
El ADN monocatenario modificado químicamente demostró la activación de Cas12a en relación con el ADN bicatenario no modificado y el ADN monocatenario. Las moléculas de ADN modificadas en orina no procesada mostraron una lectura colorimétrica en tiras de papel de flujo lateral. La banda de muestra principal indicó la liberación de FAM detectable a través de la escisión reportera desencadenada por el ADN urinario.
