Para comenzar, cultive el transformante de levadura seleccionado en tres mililitros de medio SD URA a 30 grados centígrados hasta alcanzar la saturación. Mida la densidad óptica del cultivo a 600 nanómetros. Centrifugar dos mililitros del cultivo durante la noche a 14.000 G a temperatura ambiente.
Pipetear el sobrenadante. Vuelva a suspender el gránulo en un mililitro de tampón MES. Centrifugar la mezcla a 14.000 g a temperatura ambiente.
A continuación, retira el sobrenadante. Después de lavar las células con tampón MES una vez más, vuelva a suspender las células en dos mililitros de tampón MES. A continuación, vierta todo el volumen en un depósito de reactivos.
A continuación, configure el lector de microplacas. Navegue hasta el icono de administración de protocolo y, a continuación, establezca el tipo de medición en intensidad de fluorescencia y el modo de lectura en escaneo espectral. Introduzca el nombre de la microplaca en GREINER 96 F BOTTOM y ajuste la óptica inferior.
Acceda a la configuración óptica seleccionando establecer escaneo sobre emisión. Ajuste la longitud de onda de excitación a 433 nanómetros con un ancho de banda de excitación de 10 nanómetros. Establezca el rango de longitud de onda de emisión de 460 nanómetros a 550 nanómetros con un ancho de banda de emisión de 10 nanómetros y un ancho de paso de un nanómetro.
Establezca el tiempo de ajuste en 0,1 segundos. Ahora, prepare diferentes concentraciones de solución de cloruro de sodio en los pocillos de una placa negra de fondo transparente de 96 pocillos. Cargue 150 microlitros de tampón MES en los tres primeros pocillos de la fila A. Luego, pipetee 150 microlitros de la solución de osmolita correspondiente en orden creciente de izquierda a derecha.
Con una micropipeta de 12 canales, pipetee la suspensión de levadura lavada varias veces. Luego, transfiera 50 microlitros de la suspensión celular a cada pocillo. Pipetee el contenido de cada pocillo varias veces para garantizar una mezcla uniforme.
Mida inmediatamente los espectros de emisión de intensidad de fluorescencia. Observe los espectros de emisión de fluorescencia que se muestran en la pantalla. Las construcciones IDR mostraron una combinación de espectros de emisión de mCerulean3 y citrino.
En el caso de AtLEA45, el estrés hiperosmótico provocó un aumento de la intensidad de fluorescencia del aceptor con una disminución de la intensidad de fluorescencia del donante. Esto no se observó en la construcción de la albúmina.
