Para comenzar, encienda el software de imágenes. Abra la ventana Adquirir. Establezca el tiempo de exposición en 500 milisegundos, el área de la cámara en chip completo y el agrupamiento en uno, luego configure la iluminación para el canal requerido.
Para la agitación citoplasmática, utilice la luz transmitida para enfocar el nucléolo del ovocito. Para los experimentos de motas nucleares, concéntrese en las gotas de GFP SRSF2. Para optimizar la velocidad de adquisición, en la pestaña Especial, configure el obturador de la cámara para que se abra para la exposición y el modo de borrado para borrar la secuencia previa.
A continuación, abra la ventana Adquisición de flujos. En la pestaña Adquirir, establezca el modo de adquisición en transmitir a la RAM y el número de fotogramas en 480. Establezca los parámetros de la cámara para adquirir imágenes a la velocidad de fotogramas y el número de fotogramas para saltar a cero.
En la pestaña Parámetros del controlador de cámara digital, establezca el estado de la cámara en detener, el modo de obturador en no abrir nunca, el modo de borrado en borrar la secuencia previa y el número de fotogramas en un promedio de uno. A continuación, ajuste una región de interés alrededor del objeto. En la ventana Adquisición de transmisiones, haga clic en Adquirir para iniciar la película.
Después de la adquisición, guarde la película como un archivo tiff. Para el análisis de imágenes, abra ImageJ o Fiji. En los plugins, haga clic en CIRB y abra el menú Verlhac, luego seleccione Forma del núcleo del ovocito.
En el cuadro de diálogo, seleccione la carpeta que contiene las películas que desea analizar. A continuación, seleccione el ángulo theta y los márgenes para recortar. Ahora, seleccione la calibración XY y el intervalo de tiempo, luego haga clic en OK.To trazar la forma media a lo largo del tiempo, en la hoja de cálculo, calcule el radio medio R sobre todos los puntos de tiempo T para cada ángulo theta definido.
Para cada T y theta, resta el radio medio R a lo largo del tiempo del radio r minúscula. Finalmente, calcule la media de las fluctuaciones para todos los puntos de tiempo T y todos los ángulos theta para cada núcleo y todos los núcleos de una condición. En los ovocitos control, el núcleo mostró fluctuaciones periféricas significativas como se visualizó con la sonda nuclear YFP Rango.
Por el contrario, el núcleo de los ovocitos con fuerzas citoesqueléticas alteradas se mantuvo estable a lo largo del tiempo. La variación de la distancia desde el centroide del núcleo hasta su periferia reveló un aumento de seis veces en los ovocitos de control en comparación con aquellos con fuerzas citoesqueléticas alteradas. Las manchas nucleares en los ovocitos de control mostraron una mayor fluctuación en las superficies de las gotas en comparación con las fuerzas citoplasmáticas interrumpidas.
