Transfección de células 293FT con construcciones de expresión de pCMV5-NanoLuc-CRAF y pCMV5-14-3-3ζ-Halo

Para comenzar, tome células de 293 pies cultivadas en un plato de 10 centímetros y aspire el medio. Lave las células con cinco mililitros de PBS. A continuación, añade un mililitro de tripsina EDTA, e incuba durante 3-5 minutos a 37 grados centígrados para separar las células de la placa.

Después de la incubación, agregue nueve mililitros de DMEM completo a las células para neutralizar la tripsina. Pipetea hacia arriba y hacia abajo repetidamente para generar una suspensión unicelular homogénea y transfiere las células a un tubo de 15 mililitros. Transfiera inmediatamente 20 microlitros de células a un tubo de 1,7 mililitros y mezcle con 20 microlitros de tinte de azul de tripán.

Cuente las células utilizando un contador de células automatizado o un hemocitómetro. Transfiera el volumen apropiado de células a un tubo de 50 mililitros y diluya en DMEM completo. Agregue dos mililitros de suspensión celular a cada pocillo de una placa de seis pocillos.

Incubar las células a 37 grados centígrados y 10% de dióxido de carbono durante la noche. Antes de la transfección, diluya la nanoluciferasa CRAF y 1433 plásmidos de halo zeta, junto con un vector vacío pCDNA3 en tampón TE. Etiquete un juego de tubos estériles de 1.7 mililitros.

Agregue 100 microlitros de medios de transfección a cada tubo, junto con las construcciones de expresión. Ahora agregue dos microlitros de reactivo de transfección y agite suavemente para mezclar. Haga girar los tubos brevemente en una microcentrífuga y luego incube los tubos a unos 25 grados centígrados durante 15 minutos para permitir que se formen complejos de transfección.

A continuación, se añaden complejos de transfección a las células gota a gota y se incuban a 37 grados centígrados durante 16-20 horas para expresar el halo y las proteínas nanomarcadas.