Para comenzar, etiquete tres juegos de tubos estériles de 1.7 mililitros y un juego de tubos estériles de fondo cónico de 15 mililitros. Prepare una centrífuga de cubo oscilante con insertos de tubo de 15 mililitros y preenfríe a cuatro grados centígrados. Tome la placa de cultivo celular de seis pocillos con células 293FT transfectadas.
Aspirar los medios de los pozos. Añadir 250 microlitros de tripsina-EDTA e incubar a 37 grados hasta que las células comiencen a desprenderse. A continuación, añada un mililitro de medio de ensayo suplementado con 10%FBS a cada pocillo y pipetee vigorosamente para crear una suspensión unicelular.
Transfiera un mililitro de suspensión celular a tubos de 15 mililitros preetiquetados. Agregue un mililitro de medio de ensayo suplementado con 10% de FBS a cada uno de estos tubos e invierta cinco veces para mezclar. A continuación, transfiera inmediatamente 20 microlitros de suspensión celular al juego de tubos uno.
Ahora centrifuga los tubos de 15 mililitros durante cinco minutos a 250 g en una centrífuga preenfriada. Mezcle 20 microlitros de tinción de células azul de tripán con las células del primer conjunto y cuente con un contador de células o un hemocitómetro. Después de retirar los tubos de 15 mililitros de la centrífuga, aspire los medios de los gránulos de las células y vuelva a suspender los gránulos en los medios de ensayo sin suero para crear una suspensión de una sola célula.
Para rebobinar las células en placas de 384 pocillos y seis pocillos, invierta los tubos de 15 mililitros varias veces para obtener una suspensión celular homogénea y transfiera 500 microlitros a tubos de 1,7 mililitros en el juego dos y el juego tres. Agregue 0,5 microlitros de DMSO al conjunto dos y 0,5 microlitros del ligando Halo 618 al juego de tubos tres y mezcle bien. Transfiera el DMSO y las suspensiones celulares positivas para ligandos a pocillos separados de depósitos de reactivos.
Utilice una pipeta multicanal para transferir 40 microlitros de cada suspensión a la placa de cultivo de 384 pocillos. Transfiera las células restantes a placas de cultivo frescas de seis pocillos para su posterior análisis de Western blot e incube placas de 384 pocillos y seis pocillos durante la noche a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono. Tome medios de ensayo sin suero precalentados a 37 grados centígrados.
Diluya el sustrato de nanoluciferasa descongelado 1:100 en un medio de ensayo sin suero y transfiéralo a un depósito de reactivo. Con una pipeta multicanal, transfiera 10 microlitros de mezcla de sustrato a cada pocillo de la placa de cultivo de 384 pocillos. Gire suavemente el plato durante un minuto.
Inserte la placa de 384 pocillos en un lector de placas multimodo y registre las emisiones de 460 y 618 nanómetros de todos los pocillos con celdas. Calcule las proporciones BRET brutas para vehículo positivo y ligando positivo en unidades miliBRET utilizando la ecuación dada. Calcule la relación BRET corregida restando la relación BRET positiva para el vehículo de la relación ligando positivo.
El mutante nano-CRAFS259A reduce la señal BRET en aproximadamente un 45% y el mutante nano-CRAFS621A en aproximadamente un 25%El mutante doble casi elimina la señal BRET.
