Para empezar, coloque todos los materiales necesarios para el paso de los enteroides intestinales humanos, o HIE, a la plataforma de trabajo. Mezclar los HIEs con la matriz de cultivo 3D reducida por factor de crecimiento. Siembre la mezcla en una placa de 24 pocillos con tres gotas de 10 microlitros de matriz de cultivo 3D por pocillo e incube durante 20 minutos a 37 grados centígrados.
A continuación, añada 350 microlitros del medio de crecimiento HIE. Después de siete días, recoja los HIE de cuatro pocillos en tubos de 1,5 mililitros. Centrifugar los HIE a 2000 g durante 40 segundos para eliminar los residuos.
Con una pipeta, retire el exceso de matriz de cultivo 3D del tubo. Agregue 0,5 mililitros de PBS frío en el tubo. Usando una jeringa de insulina de un mililitro, aplique la turbulencia física con una jeringa hasta 10 veces para disociar los HIE.
Centrifugar los HIEs disociados a 2000 g durante 40 segundos y retirar suavemente el sobrenadante. A continuación, coloque el tubo en hielo durante aproximadamente tres minutos. Agregue la matriz de cultivo 3D reducida con factor de crecimiento al tubo y mézclela con el pellet.
Siembre la mezcla de HIEs en la matriz de cultivo 3D en el centro de un plato redondo de 35 milímetros. Incubar la placa a 37 grados centígrados durante 20 minutos para solidificar la matriz de cultivo en 3D. A continuación, añada dos mililitros de medio de crecimiento de organoides intestinales precalentado a la placa e incube a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono durante 48 horas.
En el tercer día, reemplace el medio de crecimiento con dos mililitros de medio de diferenciación precalentado e incube a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono durante 48 horas. En el quinto día, reemplace el medio de enteroides con dos mililitros de medio de diferenciación precalentado y continúe la incubación durante 24 horas.
