Para empezar, prepare la interfaz del péptido proteico para la diversificación de secuencias. Abra el archivo PDB en quimera y asegúrese de que la estructura de las subunidades objetivo esté intacta y que no falten átomos o enlaces. Para eliminar todas las moléculas no esenciales de la estructura, haga clic en Seleccionar, luego en Residuo y luego seleccione todas las moléculas que no sean aminoácidos estándar.
A continuación, haga clic en Acciones seguido de Átomos/Enlaces y elimine. Luego, haga clic en Favoritos y Secuencia, y luego haga clic en la cadena considerada como el ligando. Recorte la cadena de ligandos al segmento interactivo identificado eliminando todos los residuos excepto los que se encuentran entre las posiciones seleccionadas.
Haga clic en Archivo y guardar PDB para guardar la estructura editada en un archivo PDB diferente. Copie este archivo en una ubicación de Linux accesible por las aplicaciones de Rosetta. Utilice la aplicación PDB fija de Rosetta para realizar un reempaquetado de todas las cadenas laterales de aminoácidos de la estructura base antes de la diversificación de la secuencia ejecutando este comando.
A continuación, cambie el nombre del archivo PDB reempaquetado con el sufijo reempaquetado de carácter de subrayado mediante el siguiente comando. A continuación, ejecute pepspec en modo de diseño para realizar la diversificación de secuencias mediante este comando. A continuación, genere un pwm utilizando el gen_pepspec_pwm.
py incluido en la Suite Rosetta. Para ejecutar este script, utilice el siguiente comando. Para crear un logotipo de secuencia, abra el archivo con las secuencias de péptidos generadas en el paso anterior con el editor de texto preferido y copie todas las secuencias.
Navegue hasta el servidor de logotipos web y pegue las secuencias en el cuadro de texto de alineación de secuencias múltiples. Elija el formato y el tamaño deseados del logotipo de acuerdo con la longitud de entrada y haga clic en crear logotipo. Utilizando este protocolo, se predijeron las preferencias de aminoácidos para el motivo pLxIS conservado en la superficie de unión de IRF5.
La posición, la matriz de peso y el logotipo de la secuencia generados tras la diversificación de la secuencia mostraron una preferencia por el glutamato en la posición 432 y por la leucina y la isoleucina en las posiciones 433 y 435. Las posiciones 427, 429 y 436 típicamente ocupadas por serina mostraron una mayor preferencia por el aspartato y el glutamato, destacando el papel de la fosforilación y la dimerización de IRF5. La posición 425 mostró una alta preferencia por la serina, lo que sugiere su participación en la interacción proteína-proteína en su forma no fosforilada.
