Para empezar, conecta la impresora 3D a un ordenador. Cargue una jeringa desechable de un mililitro con una aguja en las pinzas impresas en 3D. Utilice dos pernos de cabeza hueca M8 para asegurar las abrazaderas alrededor de la jeringa.
Gire el tornillo de avance para levantar manualmente el émbolo, creando un espacio de aire de dos mililitros en la jeringa. Para preparar cultivos de vibrio cholerae, inocule las células en tres mililitros de caldo de Luria con 10 perlas de vidrio estériles. Cultive las células en una incubadora agitadora a 37 grados centígrados durante cinco o seis horas.
Del mismo modo, inocule E. Coli en tres mililitros de caldo líquido de Luria. Después de la incubación nocturna a 37 grados centígrados, inocular 200 microlitros del cultivo en caldo fresco de Luria durante tres horas. Transfiera el cultivo a un tubo de centrífuga de 10 mililitros.
Luego, centrifugue durante cinco minutos a 644 G a temperatura ambiente. Ahora, retira el sobrenadante, y vuelve a suspender el pellet en 10 microlitros de caldo líquido de Luria. A continuación, cargue una jeringa vacía de plástico de tres mililitros en la bioimpresora 3D.
Conecte el émbolo de la jeringa con el tornillo de avance. Retraiga la jeringa manualmente para transferir el espacio de aire para permitir un mejor movimiento del émbolo. Coloque una aguja roma del tamaño adecuado en la punta de la jeringa.
Gire manualmente el tornillo para retraer el émbolo de la jeringa y cargue la suspensión bacteriana en la jeringa. Para preparar la mezcla de hidrogel granular, mezcle gránulos secos de ácido acrílico reticulado con 400 mililitros de caldo Lennox Luria-Bertani al 2%. Ajuste el pH a 7.4 con incrementos de 500 microlitros de hidróxido de sodio molar de 10 molares y pruebe el pH en una tira reactiva.
Use una jeringa de plástico estéril de 50 mililitros para transferir la mezcla de hidrogel a un tubo de centrífuga de 50 mililitros. Centrifugar la matriz a 161 G durante un minuto a temperatura ambiente. A continuación, utilice una jeringa de 30 mililitros para transferir el volumen requerido de la matriz a un recipiente donde se realizará la impresión.
A continuación, coloque los recipientes de muestra con la matriz de hidrogel en los soportes de la plataforma de impresión de la impresora. Inicie el software de impresión 3D. Haga clic en archivo, luego presione abrir archivo para cargar un gcode preprogramado en el software.
Introduzca la longitud del movimiento. A continuación, mueva los planos X, Y, Z para centrar los cabezales de impresión en el plano X/Y. Pulse el icono de inicio para reajustar el eje Z.
Gire manualmente el tornillo lentamente para presionar el émbolo de la jeringa hasta que se vea una pequeña cantidad de suspensión bacteriana en la punta de la aguja. Limpie el exceso de suspensión con una toallita desechable estéril. Ahora, baje el cabezal de impresión a una distancia fija en el medio de hidrogel de cualquier recipiente de muestra.
Haga clic en imprimir para comenzar a imprimir. Una vez finalizada la impresión, cierre los recipientes de muestra. Deseche la jeringa y la aguja de manera adecuada.
Limpie la impresora con etanol al 70%. Para obtener imágenes de gran campo de visión, utilice una cámara con un objetivo zoom acoplado. Cree una imagen de las celdas justo después de imprimir a temperatura ambiente.
Luego, transfiera las muestras a una incubadora a 37 grados centígrados. Las diferencias en el tamaño de los poros de la matriz no parecieron afectar a la diseminación celular no modal. Sin embargo, las células modales se propagan más rápido en la matriz con poros más grandes en relación con los poros más pequeños.
La colonia de vibrio cholerae en matrices de hidrogel con poros más grandes se extienden a través de plumas lisas y difusas. Los penachos difusos estaban ausentes en las células no modales. La colonia en matrices de hidrogel con poros más pequeños se propaga solo a través de plumas rugosas, similares a fractales, tanto para las células modales como para las no modales.
Se observó que ambas células se propagaban a tasas similares durante las primeras 150 horas. Sin embargo, durante períodos más largos, algunas muestras mostraron tasas de propagación más rápidas. Después del experimento, se observó una disminución del estrés de rendimiento, los módulos de almacenamiento y los módulos de pérdida en el hidrogel.
