Para comenzar, transfiera todo el cultivo del virus adenoasociado HEK293 precipitado en PEG a un tubo cónico grande. Centrifugar el cultivo a 2.820 g durante 15 minutos a 4 grados centígrados. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el gránulo en 15 mililitros de PBS con calcio y magnesio.
Transfiera la parte resuspendida a un tubo de 50 mililitros. Agregue 10 mililitros de PBS para recolectar el precipitado PEG restante y transfiéralo todo a un tubo de 50 mililitros. A continuación, añadir 40 microlitros de DNasa I, e incubar durante una hora a 37 grados centígrados.
Con una pipeta Pasteur de vidrio, llene un tubo de polialómero de 25 milímetros por 89 milímetros con 15,5 mililitros de lisado celular concentrado. Con una nueva pipeta Pasteur de vidrio, infunda suavemente nueve mililitros de la solución de yodixanol al 15% debajo del lisado celular. A continuación, agregue cinco mililitros de las soluciones de yodixanol al 25% y al 40%.
Y, por último, agregue cinco mililitros de la solución de yodixanol al 60%. Use una jeringa para llenar el tubo con PBS, asegurándose de que se eliminen la mayoría de las burbujas de aire sin alterar las capas de yodixanol. Selle el tubo con un adorno de tubo eléctrico.
Compruebe que las diferentes capas del gradiente de yodixanol sean claramente visibles. Centrifugar los tubos con un rotor no oscilante a 490.000 g durante una hora y 10 minutos a 16 grados centígrados. Después de la centrifugación, ensamble los tubos en un broche de metal.
Coloque una aguja de calibre 19 en la jeringa. A continuación, crea una punción en la parte superior del tubo con una aguja de calibre 30, dejando la aguja insertada. Perfore con cuidado el tubo justo debajo de la interfaz 40%60%iodixanol, como lo indica el indicador rojo de fenol.
Asegúrese de que el bisel de la aguja mire hacia la capa del 40%. Retire la aguja de calibre 30 con la mano no dominante mientras extrae lentamente la mezcla de virus y yodixanol. Aproximadamente a la mitad, gire la aguja para que el bisel quede hacia abajo y continúe la extracción, evitando la recolección de la capa de proteína.
Después de la extracción, transfiera inmediatamente el tubo de ultracentrífuga a un tubo de 50 mililitros para desecharlo. Agregue la suspensión de AAV-yodixanol recolectada a un tubo de 15 mililitros y dilúyalo cinco veces en PBS, llenando hasta 15 mililitros. Transfiera la suspensión a un tubo de filtro centrífugo y centrifugue a 3, 428 g durante 10 minutos a 4 grados centígrados.
Después de desechar el flujo, agregue 15 mililitros de sacarosa PBS al 5% al filtrado y vuelva a suspender. Recoja el AAV concentrado del tubo del filtro centrífugo. Por último, almacene la alícuota del virus a 4 grados centígrados durante un máximo de tres meses.
