Para comenzar, tome un cultivo confluente del 70 al 90% de fibroblastos uterinos humanos. Aspire el medio de los matraces. Lavar las células con cinco mililitros de DPBS tibio libre de calcio y magnesio.
Después de aspirar el DPBS, pipetee cuatro mililitros de tripsina EDTA tibia en cada matraz. Incube las células a 37 grados centígrados durante tres a cinco minutos hasta que las células se desprendan. A continuación, agregue seis mililitros de goteos y solución neutralizante en cada matraz.
A continuación, transfiera la suspensión de la célula a un tubo cónico de 15 mililitros. Utilice una pipeta para mezclar bien la suspensión y tome una alícuota de 10 microlitros para el recuento de células. Mezclar 10 microlitros de la suspensión celular con 10 microlitros de Azul Trypan.
Transfiera la suspensión celular teñida a un hemocitómetro para el recuento de células. A continuación, centrifugar la suspensión celular a 300 G durante cinco minutos a temperatura ambiente. Después de aspirar el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet en un medio fibroblasto tibio.
Ahora lave el canal basal de un chip de órgano microfluídico con 200 microlitros de medio fibroblasto. A continuación, lavar el canal apical con 200 microlitros de medio epitelial vaginal calentado. Agregue 200 microlitros de medio epitelial vaginal completo a la entrada del canal apical, mientras tapa la salida con una punta de pipeta.
Dispense el medio hasta que los volúmenes de las puntas de entrada y salida sean iguales. A continuación, suelte la punta de la pipeta y déjela en la entrada. Pipetear lentamente 50 microlitros de la suspensión de células de fibroblastos uterinos humanos en la entrada del canal basal, mientras se aspira simultáneamente desde la salida.
Retire la punta de la pipeta de la entrada cuando queden aproximadamente dos microlitros de la suspensión celular en la punta de la pipeta. Dale la vuelta a las virutas de los tapones en una rejilla de tubo de 15 mililitros. Revise los chips después de la incubación para ver si se adhieren a las células.
A continuación, enchufe la salida del canal basal con una punta de pipeta. A continuación, añada 200 microlitros de medio fibroblasto a la entrada del canal basal sin empujar hacia abajo el émbolo de la pipeta. Suelte la punta de la pipeta para permitir que el medio fluya libremente a través del canal hasta la punta de la pipeta de salida mediante flujo gravitacional.
Incubar las patatas fritas sembradas con fibroblastos durante la noche a 37 grados centígrados con un 5% de suplementación con dióxido de carbono.
