Para empezar, etiqueta dos tubos de microcentrífuga de mililitros. Pipetear 50 alícuotas de microlitros de cultivos de E. coli DnaK756 en los tubos. Coloque los tubos sobre hielo.
Agregue de 10 a 50 nanogramos de ADN plasmídico en cada tubo separado con las alícuotas de E. coli. Mantenga los tubos en hielo durante 30 minutos. A continuación, coloque las celdas a 42 grados centígrados durante 60 segundos para realizar un choque térmico en las celdas.
Regrese los tubos a hielo durante 10 minutos. Pipetear 950 microlitros de caldo de triptona de levadura fresca dos veces en los tubos, luego incubar los tubos en una coctelera a 37 grados centígrados. Pipetear 100 microlitros del cultivo celular transformado y extenderlos en placas de agar con dos veces triptona de levadura que contenga antibióticos.
Centrifugar el resto de las células durante un minuto a 5.000 G a cuatro grados centígrados. Decantar unos 800 microlitros del caldo. Vuelva a suspender las células peletizadas en el medio restante.
Coloque las células recuperadas en una placa de agar triptona de dos veces levadura, luego incube ambas placas de agar a 37 grados centígrados durante la noche. Para colocar placas en las células, use un asa estéril para recoger una sola colonia de los transformantes. Inocularlo en 10 mililitros de caldo de triptona de dos veces levadura, suplementado con antibióticos.
Ahora, prepare diluciones seriadas de las celdas de 100 a 10 al quinto negativo en tubos de microcentrífuga de dos mililitros. Antes de detectar las células, coloque placas de agar suplementadas con antibióticos e IPTG en un horno a 40 grados centígrados con las tapas parcialmente abiertas. Una vez que las placas estén lo suficientemente secas, coloque dos microlitros de las células diluidas en serie en las placas de agar.
Coloque cada muestra en dos platos separados. Incubar una placa a la temperatura de crecimiento permisiva de 37 grados centígrados y la otra a la temperatura de crecimiento no permisiva de 43,5 grados centígrados. Para confirmar la expresión de proteínas recombinantes, utilice un bucle estéril para recoger parte de las células restantes de la misma colonia de transformantes.
Inocular las células en 10 mililitros de caldo de triptona de levadura suplementado con antibióticos. Incubar los cultivos en una coctelera durante la noche a 37 grados centígrados. Todas las células de E. coli DnaK756 crecieron a la temperatura de crecimiento permisiva de 37 grados centígrados.
Sin embargo, solo las células heterólogas que expresan DnaK y KPf crecieron a la temperatura de crecimiento no permisiva. Las células mutantes que expresan KPf-V436F solo crecieron a 37 grados Celsius, pero no crecieron a 43,5 grados Celsius.
