Para comenzar, encienda el gabinete de flujo de aire laminar, permitiendo que se estabilice durante tres minutos. Limpie y desinfecte asépticamente las superficies internas del armario con los siguientes agentes desinfectantes. Después de desinfectar cualquier material que ingrese al gabinete, coloque servilletas y guantes de nitrilo en el gabinete.
A continuación, apague el armario y expóngalo a la luz ultravioleta durante 15 minutos. Después de la irradiación, reinicie el gabinete. Coloque los reactivos de diseño de imprimación en una hielera llena de hielo.
Después de desinfectarlo con etanol al 70%, coloque el recipiente dentro del gabinete. Prepare la amplificación isotérmica mediada por bucle, o mezcla LAMP, en un tubo de microcentrífuga de 0,6 mililitros. Pipetear la mezcla para homogeneizarla.
A continuación, incube los tubos cerrados en un bloque calefactor a 95 grados centígrados durante cinco minutos. A continuación, enfríe los tubos en una nevera de poliestireno llena de hielo durante cinco minutos. Después de enfriar, coloque los tubos en la cabina de flujo laminar.
Para completar la mezcla de LAMP, agregue cuatro microlitros de ADN polimerasa, seguidos de un microlitro de transcriptasa inversa. Para realizar la detección colorimétrica, agregue el azul de dihidroxinaftol. Después de la adición de reactivos, pipetee cada solución para mezclar correctamente los reactivos LAMP.
A continuación, pipetee 22 microlitros de la solución en tubos de PCR, teniendo cuidado de no crear burbujas. Para el control negativo, añadir tres microlitros de agua de pirocarbonato dietílico al 0,1%. Mantenga a un lado los tubos restantes para la adición de material genético.
A continuación, retire todos los materiales del gabinete. Después de desinfectar las superficies del gabinete con etanol al 70%, apáguelo. En un área aparte, agregue tres microlitros de la muestra a cada tubo de PCR y pipetee bien con una micropipeta de 20 microlitros para homogeneizar completamente.
Antes de iniciar la reacción colorimétrica, utilice una cámara de alta calidad para tomar fotografías de los tubos de PCR. Ahora, lleve a cabo la reacción utilizando un termociclador y un baño de agua. Para el termociclador, coloque los tubos en el bloque de reacción y configure el perfil térmico en el equipo.
Si usa el baño de agua, coloque los tubos de forma segura en recipientes circulares, luego coloque estos recipientes en el baño de agua a 66,3 grados centígrados durante 60 minutos. Pasado el tiempo de reacción, retire los tubos y guárdelos a cuatro grados centígrados hasta su uso. Si se realizó una reacción colorimétrica, capture imágenes de la PCR con una cámara de alta calidad.
Un gradiente de temperatura demostró que la temperatura óptima de fusión era de 66,3 grados centígrados. La concentración de la enzima BST 3.0 se optimizó a 3.2 unidades internacionales por microlitro. Para definir la estrategia colorimétrica se evaluó el rojo fenol en tintes rojos neutros.
Sin embargo, no se observó ningún cambio de color después de la amplificación. Se realizó la estandarización de diferentes concentraciones de azul de hidroxinaftol, y el cambio óptimo se produjo con 125 micromoles de azul de hidroxinaftol. Las muestras amplificadas demostraron un cambio en el color de acuerdo con su concentración.
La amplificación de la muestra se confirmó mediante electroforesis.
