Para comenzar, coloque el ratón eutanasiado en decúbito supino sobre la tabla de disección. Usando pines en T de disección, asegure las almohadillas de los pies del mouse al tablero. Con unas tijeras de disección quirúrgica, haga una incisión en la parte inferior del abdomen y corte hasta la barbilla.
Después de separar la piel del revestimiento peritoneal, estírela perpendicularmente lejos del tronco y sujétela con alfileres. Empleando pinzas romas, extraiga cuidadosamente los ganglios linfáticos cervicales, axiales, braquiales e inguinales, así como el bazo y colóquelos en un filtro celular de 70 micrómetros que contenga dos mililitros de medio R9. Para preparar una suspensión de una sola celda, gire la herramienta de disrupción de tejido media vuelta en el sentido de las agujas del reloj y en el sentido contrario a las agujas del reloj repetidamente.
Lave el colador con cinco mililitros de medio. Luego, transfiera la suspensión celular a un tubo cónico de 15 mililitros y centrifuérrelo. Después de decantar el sobrenadante, agregue 500 microlitros de tampón lisante al tubo para eliminar los glóbulos rojos.
Después de un minuto, mezcle las celdas con 9,5 mililitros de medio R9. Centrifuga el tubo. Y decantar bien el sobrenadante.
A continuación, vuelva a suspender el pellet celular en 10 mililitros de medio de selección negativa que contenga anticuerpos anti-MHC2 y anti-CD4, y coloque el tubo en un balancín durante 30 minutos. Después de peletizar las células a 270 g durante cinco minutos, decantar el sobrenadante. Simultáneamente en un tubo cónico de 15 mililitros, lavar 200 microlitros de perlas anti-ratas de oveja e inmunoglobulina G en siete mililitros por medio.
Coloque el tubo en un imán y retire el medio. Después de lavar dos veces más, vuelva a suspender las perlas en siete mililitros de R9 medio. Luego, mezcle siete mililitros de la suspensión de cuentas con el pellet de celda e incube el tubo en un balancín.
Para eliminar las células unidas a las perlas de anticuerpos, coloque el tubo cónico directamente sobre el imán durante tres minutos. Aspire la suspensión celular en un nuevo tubo de 15 mililitros, manteniendo el tubo en el imán. Granular las células CD8 positivas enriquecidas y lavar tres veces a fuego medio.
