Para empezar, realice imágenes de lapso de tiempo de linfocitos T vivos aislados de tejidos linfoides secundarios murinos. Para el análisis de migración de células T, abra el software Velocity y cree una nueva secuencia de imágenes. Seleccione y mueva las películas de microscopía de vídeo de lapso completo al área azul de Velocidad.
Utilizando la herramienta de mejora del contraste, modifique el brillo y el contraste, luego ajuste los tamaños de imagen a 0,325 micrómetros para 20x y 0,65 micrómetros para aumentos de 10x. Después de configurar la secuencia para establecer puntos de tiempo, vaya a la pestaña de medición y desmarque todos los puntos de tiempo. A continuación, busca objetos usando la intensidad y desliza la barra hacia la derecha del pico.
Para evitar residuos celulares, excluya todas las celdas de menos de 10 micrómetros y más de 100 micrómetros de diámetro. Marque ignorar objetos estáticos seguidos de unirse automáticamente a pistas rotas. Para guardar un nuevo protocolo, vaya a mediciones.
Haga clic en Guardar protocolo, seguido de Nombre nuevo protocolo. En la pestaña de medición, haga clic en medir todos los puntos de tiempo y ordene las pistas por intervalo de tiempo de mayor a menor. Después de grabar los números de identificación de pista para las celdas con buenas pistas, exporte el archivo como texto separado por comas y transfiera los datos al software de análisis deseado.
Para realizar el seguimiento manual, abra la imagen J, vaya a complementos y seleccione seguimiento y seguimiento manual. Establezca los intervalos de tiempo de calibración X por Y, tamaño de píxel y calibración Z. A continuación, haga clic en agregar pista para iniciar el seguimiento de celdas individuales.
Seleccione una celda en el primer punto de tiempo y continúe a través de todos los puntos de tiempo. Finalmente, haga clic en finalizar pista. El seguimiento celular asistido por software, caracterizó los comportamientos migratorios de las células T individuales activadas como se denota por las líneas de diferentes colores.
