Inclusión y criosección de tejido ocular en un compuesto de temperatura de corte óptima para la obtención de imágenes de fluorescencia

Una vez completada la crioprotección del ojo de conejo, transfiéralo de una solución de sacarosa al 30% a un plato de disección de 100 milímetros. Bajo un microscopio de disección, voltee cuidadosamente el ojo para eliminar el exceso de solución de sacarosa de la parte interna del ojo. Con una toallita, limpie suavemente el exceso de solución de sacarosa de la parte exterior del ojo, llene un molde de inclusión desechable con una temperatura de corte óptima o un compuesto OCT a una profundidad de 0,5 a un centímetro.

Coloque el ojo en el molde de inclusión mirando hacia arriba y llene lentamente la parte interna del ojo con compuesto OCT, evitando la formación de burbujas. Una vez que el ojo esté emergido en el compuesto OCT, y no toque las superficies internas del molde, envuelva el molde de inclusión en parafina y guárdelo a cuatro grados centígrados durante la noche. Al día siguiente, coloque el molde de inclusión en una placa de disección.

Si es posible, retire suavemente el compuesto OCT del interior del ojo con una toallita. Transfiera el ojo a un nuevo molde de inclusión lleno de compuesto OCT fresco. A continuación, llene el molde como se ha hecho anteriormente para asegurarse de que el medio de inclusión final esté libre de residuos o imperfecciones.

Etiquete el molde con fines orientativos. Coloque el ojo hacia arriba en el molde criogénico, de modo que el compuesto OCT recubra la retina interna. Use la cabeza del nervio óptico como punto de referencia para determinar la parte superior del ojo. Coloque el molde de inclusión etiquetado sobre hielo seco, asegurándose de que el ojo no toque las superficies internas del molde ni se exponga al aire.

Monte el bloque en el criostato con la parte superior del ojo hacia arriba y la parte inferior hacia abajo. Con la córnea y el iris restantes mirando hacia la derecha o hacia la izquierda. Coloque una cuchilla nueva paralela al eje vertical del ojo para seccionarlo.

Después de cortar las secciones y secar durante la noche, coloque un portaobjetos en un congelador a 80 grados centígrados. Las imágenes de fluorescencia de una criosección de retina completa de ojo de conejo demostraron una capa uniforme de epitelio pigmentado de la retina sin un desprendimiento significativo de la capa fotorreceptora suprayacente. Una imagen de campo claro de la sección de la retina demuestra además la morfología retiniana intacta de todas las capas.