Para comenzar, obtenga la región lumbar de la columna vertebral del cachorro en un plato que contenga un medio de disección frío. Usando un microscopio estereoscópico de disección y unas tijeras, corte la columna vertebral a lo largo del eje sagital. Con pinzas rectas, retire suavemente la médula espinal de la cavidad de la columna vertebral y retire con cuidado las meninges de la región lumbar aislada de la médula espinal, o SC. Transfiera e incube la región lumbar SC aislada en un medio de disección frío y fresco durante 10 a 15 minutos.
Con una pipeta Pasteur de plástico, coloque el tejido en la plataforma de corte del instrumento picador perpendicularmente a la cuchilla. Después de retirar el medio de disección residual, proceda con el corte automatizado del SC. Con una pipeta Pasteur, transfiera las rodajas e incube con medio de disección fresco en un plato de 35 milímetros durante 15 minutos. Lave la superficie del inserto de membrana de cultivo tres veces con medio organotípico, o OM, y deje un mililitro de medio en la parte inferior del inserto de membrana.
Examine las rodajas bajo el microscopio estereoscópico de disección y siembre el número deseado de rodajas en los insertos de membrana acondicionados. Después de ajustar la orientación de las rodajas y eliminar el exceso de medio, incubarlas a 37 grados centígrados durante 30 minutos. Luego, transfiera el inserto a una nueva placa de Petri y agregue un mililitro de OM fresco suplementado con GDNF en la parte inferior del inserto de membrana.
Incuba las rodajas a 37 grados centígrados. El primer día ex vivo, reemplace el medio antiguo por OM fresco. Al tercer día, cambie a un medio de injerto suplementado con GDNF y agregue GDNF fresco al medio todos los días hasta el día ex vivo siete. Para el resto del cultivo a largo plazo, agregue GDNF solo cuando se cambie el medio.
El ensayo de inmunofluorescencia de cortes organotípicos SC de ratón cultivados a largo plazo reveló una amplia distribución del marcador citoesquelético neurofilamento y el marcador neuronal nuclear RBFOX3, lo que atestigua su condición saludable e identidad neuronal.
