Construcción a gran escala de plásmidos UAS-cDNA/ORF mediante ensamblaje modular basado en CRISPR (CRISPRmass)

Para realizar las reacciones paralelas de tubo de ensayo de dos pasos del ensamblaje modular basado en CRISPR o CRISPRmass, proceda a escindir los esqueletos vectoriales idénticos de los plásmidos cDNA / ORF mediante Cas9 sgRNA en el primer paso de la reacción del tubo de ensayo. Para hacerlo, coloque tubos de 0.2 mililitros debidamente etiquetados en un bloque de enfriamiento de aluminio sobre hielo. Prepare la mezcla maestra para el número N de reacciones mezclando cantidades adecuadas de Cas9, sgRNA, tampón Cas9 y agua tratada con DEPC.

Una vez que se agregan los componentes de la mezcla maestra, vórtelos para garantizar una mezcla adecuada. A continuación, gire la mezcla y alícuota dos microlitros de la mezcla maestra a cada tubo de 0,2 mililitros. A continuación, añada 0,4 microlitros de plásmido ADNc/ORF de 0,019 micromolares a cada tubo.

Incubar las reacciones de escisión a 37 grados centígrados durante una hora. En la siguiente reacción de tubo de ensayo, paso dos, proceda a insertar un módulo UAS específico del vector en los plásmidos linealizados de ADNc/ORF Cas9 resultantes. Para configurar la reacción de un solo paso de 1,4 microlitros para cada muestra, coloque los tubos de 0,2 mililitros etiquetados en un bloque de enfriamiento de aluminio sobre hielo.

Prepare la mezcla maestra para un número N de reacciones mezclando cantidades adecuadas de módulo UAS y mezcla maestra de ensamblaje de reacción de un solo paso. Agita bien la mezcla antes de reducirla. A continuación, alícuota 0,77 microlitros de la mezcla maestra a cada tubo.

Añadir 0,7 microlitros de plásmido linealizado Cas9 cDNA/ORF a la alícuota de cada tubo e incubar las reacciones a 50 grados centígrados durante una hora.