Para empezar, aislar y canular los vasos linfáticos mesentéricos de la rata eutanasiada. Presurizar los vasos linfáticos en la cámara de profusión y permitir que se equilibren y desarrollen contracciones espontáneas estables. A continuación, incube los vasos linfáticos con Fura-2-acetoximetílico éster y ácido plurónico durante 30 minutos en la oscuridad.
Después de la incubación, vacíe el volumen completo del baño con un vacío de presión negativa y vuelva a llenarlo con la solución salina fisiológica sin reactivos a la misma temperatura tres veces. A continuación, incubar los vasos linfáticos en la oscuridad durante 15 minutos más para eliminar cualquier exceso de indicador y permitir la desesterificación. Transfiera la cámara a un microscopio fluorescente invertido con luz LED, objetivo fluor 20XS, adaptador de autoencuadre y cámara para captura de fluorescencia de 15 hercios.
Conecte el microscopio a una computadora equipada con software de imágenes para registrar la fluorescencia y realizar la detección de bordes. Active la fuente de luz LED y la interfaz del sistema fluorescente. Ahora inicie el software IonWizard.
En la pestaña Archivo, seleccione la opción Nuevo. A continuación, vaya a la pestaña Recopilar y seleccione Experimentar. Cargue la plantilla experimental deseada y haga clic en Aceptar. Haga clic en el botón Inicio ubicado en la parte inferior de la pantalla para iniciar el experimento.
A continuación, ajuste las trazas en pantalla para mostrar el diámetro del recipiente, el numerador, la señal 340, el denominador, la señal 380 y la relación en orden descendente. Para modificar la escala del eje Y para una mejor visualización del seguimiento, vaya a Seguimientos, asegúrese de que Límites automáticos esté desactivado y seleccione Editar límites de usuario. Seleccione el parámetro que desea ajustar, introduzca los valores mínimo y máximo para el eje y, a continuación, seleccione Aceptar para confirmar.
Con el software de detección de bordes, ajuste la iluminación para que la pared de los vasos linfáticos aparezca como líneas oscuras. Seleccione una región de interés o ROI libre de grasa y residuos, y asegúrese de no mover este ROI. Establezca el umbral de modo que el borde de la pared del recipiente se detecte durante todo el ciclo de contracción.
Después de activar el tubo fotomultiplicador, el uso de iluminadores LED alterna longitudes de onda de 340 y 380 nanómetros y exposiciones de 50 milisegundos para excitar Fura-2. Capture los espectros de emisión a 510 nanómetros y 15 hercios en todo el campo de imágenes. Para medir la relación señal/fondo, primero obtenga la fluorescencia 340 y 380 con el vaso linfático en el centro del campo de visión.
A continuación, mueva el campo de visión al borde de la bañera sin recipiente para capturar el fondo. A continuación, cambie la solución de baño por una solución salina fisiológica sin reactivos y a temperatura adaptada para eliminar el exceso de Fura-2 indicador. Registre la señal fluorescente basal de Fura-2 y las contracciones espontáneas durante unos 30 minutos.
A continuación, registre la respuesta a la concentración acumulada de nifedipino y obtenga mediciones de fondo para cada concentración del fármaco. Al final de cada experimento, lavar los vasos linfáticos con una solución salina fisiológica libre de calcio y a temperatura adecuada para obtener la señal fluorescente mínima de Fura-2 y el diámetro máximo de los vasos linfáticos en ausencia de iones de calcio. Cambie la solución de baño por una solución salina fisiológica a temperatura adaptada que contenga 10 iones de calcio milimolares e ionomicina para obtener la señal fluorescente máxima de Fura-2 y el diámetro mínimo de los vasos linfáticos en condiciones de saturación de iones de calcio.
Los parámetros, incluida la amplitud del pico de calcio, el calcio basal y el calcio máximo, mostraron una reducción dependiente de la concentración con la adición incremental de nifedipino a la cámara de perfusión. Al mismo tiempo, los parámetros contráctiles, como la contracción, la amplitud y el flujo calculado, también mostraron una disminución escalonada. Los diagramas de Manhattan mostraron las respuestas individuales de los vasos linfáticos para las medidas de ritmicidad, incluido el intervalo, el tiempo de contracción y el tiempo de relajación.
