Para empezar, siembra células HEK293T en una fábrica de células de 10 capas que contiene medios de alta glucosa DMEM con 10% de FBS. Coloque las células en una incubadora a 37 grados centígrados bajo un 5% de suplementación de dióxido de carbono durante la noche. A continuación, alícuota 350 mililitros de Opti-MEM en un frasco estéril de 500 mililitros.
Agregue el ADN del plasma para la transfección en el frasco y agite para mezclar bien. Ahora agregue 15 mililitros de solución de PEI en la botella. Agite la mezcla vigorosamente durante 30 segundos para asegurar una mezcla uniforme.
Después de incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 15 minutos, transfiérala a una botella de un litro. A continuación, añada 700 mililitros de DMEM bajo en glucosa. Retire la Cell Factory de 10 capas de la incubadora y aspire los medios en un contenedor de residuos.
Pipetea con cuidado la mezcla transfectuada de ADN en la fábrica de células. A continuación, vuelva a colocar la Cell Factory en la incubadora durante 72 a 96 horas. Después de tres o cuatro días, filtre el sobrenadante clarificado a través de una unidad de filtro de 0,45 micrómetros.
Agregue 500 mililitros de DPBS en la fábrica de celdas para enjuagarlo. Centrifugar a 4.000 g durante 20 minutos a cuatro grados centígrados. Con un sistema de vacío y una pipeta de aspiración, retire y deseche el sobrenadante.
Agregue 20 mililitros de tampón de lisis AAV al gránulo y mezcle para resuspender el gránulo en el tampón. Almacene a menos 80 grados centígrados hasta la purificación. Ahora agregue una solución de cloruro de sodio al 40% de PEG a la solución de AAV, lo que hace que la concentración final sea de hasta 8% de PEG.
Coloque la mezcla en un rotador orbital de baja velocidad durante la noche a cuatro grados centígrados. Centrifugar la solución a 4.000 g durante 30 minutos a cuatro grados centígrados para precipitar el virus. Pipetea el sobrenadante.
Luego tenía de cinco a 10 mililitros de AAV HEPES Resuspension Buffer a la pastilla de pellet. Transfiera la suspensión a un tubo cónico de 50 mililitros para continuar con la purificación posterior. A continuación, fije una aguja puntada de calibre 16 colocada en una jeringa de 10 mililitros y superponga los gradientes de yodixanol preparados en un tubo de ultracentrífuga de polipropileno de superficie redonda.
Con una aguja de calibre 22, agregue cuidadosamente hasta 17 mililitros de la solución AAV sobre el gradiente. Rellene el tubo con tampón de diálisis AAV. Sella los tubos con un sellador eléctrico.
Centrifugar los tubos a 350.000 g durante dos horas en un rotor de titanio a cuatro grados centígrados. Luego transfiéralos a una rejilla de tubos de ultracentrífuga. Ahora use una nueva aguja de calibre 18 para transferir el virus AAV a un casete de diálisis.
Retire el aire del casete después de inyectar el virus en él. Coloque una barra de agitación en el vaso de precipitados que contiene el tampón de diálisis AAV y transfiérala a una placa de agitación. A continuación, coloque el casete de diálisis en el tampón con una boya flotante.
Use una jeringa de 10 mililitros para transferir el virus del casete a una unidad de filtro centrífugo. Centrifugar a 4.000 g durante 15 a 30 minutos a cuatro grados centígrados. Recoja el AAV concentrado de la unidad de filtro.
A continuación, enjuague el filtro con 300 microlitros de tampón de diálisis AAV. Finalmente, transfiera la solución de enjuague al AAV concentrado. Se descubrió que el virus AVV aislado tenía una pureza superior al 90%, lo que lo hacía adecuado para su uso in vivo.
