Comience por diseccionar el hipocampo de un cerebro de ratón embrionario y coloque el tejido disecado en un tampón libre de calcio y magnesio helado o CMF. A continuación, retire el CMF y enjuague el pañuelo cuatro veces con CMF fresco y frío, girando suavemente el tubo entre enjuagues. A continuación, añada una solución filtrada de tripsina al 0,125% e incube durante 15 minutos a 37 grados centígrados, agitando cada cinco minutos.
Después de la incubación, retire la solución de tripsina y lave dos veces con CMF helado. A continuación, añada tres mililitros de solución de inactivación de tripsina. A continuación, para disociar las células, titule 30 veces con dos segundos extractos con una aguja de calibre 14 conectada a una jeringa de tres mililitros.
Continúe la valoración con dos segundos extraídos 30 veces con una aguja de calibre 15, luego 20 veces con una aguja de calibre 16, seguidas de 20 veces con una aguja de calibre 18. A continuación, realice tres segundas extracciones con una aguja de calibre 21 15 veces para completar la disociación celular. Compruebe si hay grumos de células colocando una gota de la suspensión celular en un portaobjetos de microscopio.
A continuación, filtre cinco mililitros de FBS con un filtro de jeringa de 0,22 micras. Coloque suavemente la suspensión celular en el FBS en un tubo cónico de 15 mililitros. Centrifugar las células a 200 x g a cuatro grados centígrados durante cinco minutos.
Retire FBS y vuelva a suspender el pellet en un mililitro de medio neurobasal tibio libre de antibióticos. Diluir la suspensión celular en azul de tripano al 0,4% y obtener un recuento de células. Coloque las células en 750 microlitros de medios neurobasales libres de antibióticos en un portaobjetos de 4 pocillos recubierto de poli-D-lisina precalentado.
Incubar las células en una cámara con humedad controlada a 37 grados centígrados y 5% de CO2.
