Prepárese para la obtención de imágenes con un microscopio confocal dos días después de la transfección de las neuronas primarias del hipocampo. Caliente el accesorio de la cámara de células vivas 60x subjetivo y el aceite de la lente a 37 grados Celsius y equilibre la cámara al 5% de CO2. Usando las piezas oculares, identifique las neuronas transfectadas en el canal que contiene la proteína de carga.
A continuación, haga clic en escanear para obtener una imagen de las neuronas e identificar el segmento inicial del axón del canal SCI-5. Establezca el campo de visión en una caja rectangular de 32 por 128 píxeles y muévala para obtener una imagen de una región del axón, de 50 a 150 micras distal al segmento inicial del axón. Registre la direccionalidad del transporte de carga y la orientación del ROI, luego presione guardar como para guardarlo como archivo.
Tenga en cuenta que los puntos de la caja aparecerán en la parte superior y derecha en las imágenes siguientes. Registre el lado de la imagen más cercano al cuerpo de la célula y el lado más cercano al extremo del axón para garantizar la orientación correcta de la polilínea del comógrafo. Establezca la potencia del láser 561 en 1,40, el agujero de alfiler en 7,8, el tamaño en 128 píxeles cuadrados y la velocidad en 32 fotogramas por segundo.
Ajuste la ganancia para visualizar el transporte de vesículas de carga individuales sin que la señal de fondo la oscurezca. Selecciona dibujar ROI rectangular en el menú desplegable ROI y dibuja el ROI para que cubra todo el campo de visión. A continuación, haga clic con el botón derecho y seleccione usar como estimulación ROI S1. Luego, en la pestaña de configuración de ND, haga clic en adquirir imagen para recopilar la imagen de referencia previa a la estimulación.
A continuación, ajuste la estimulación a ROI S1, el intervalo a sin retraso, la duración de 1,64 segundos y los bucles a siete. Luego haga clic en adquirir imagen para recopilar la imagen de referencia posterior a la estimulación. Seleccione esperar, sin adquisición, dos minutos para proporcionar un período de recuperación para que la carga fluorescente vuelva a poblar el ROI blanqueado.
Seleccione intervalo de adquisición, sin retraso, duración cinco minutos, bucles, 8, 615. Haga clic en el botón aplicar configuración de estimulación en la pestaña de configuración de ND, seguido de ejecutar ahora. También recopile videos de transporte de al menos dos neuronas para su análisis.
Restablezca el campo de visión a toda la imagen y luego recopile una imagen de la neurona completa en los canales 561 y 647 con la caja ROI incluida. Registre las coordenadas XY donde se tomó la imagen para la confirmación posterior a la fijación de la expresión de proteínas. Mediante este protocolo se realizaron imágenes de células vivas de una neurona transfectada que expresa la sinaptofisina de mAPL.
También se marcó el dominio externo de neuro fasina en el segmento inicial del axón. Las imágenes del transporte de carga se realizaron en la región axonal de interés. Otros análisis de inmunofluorescencia posteriores a la obtención de imágenes confirmaron la coexpresión de la proteína tau y la sinaptofisina mAPL.
