Para comenzar, tome las células del músculo esquelético teñidas con cisplatino, anticuerpos conjugados metálicos y solución intercaladora de iridio, y granule las células por centrifugación. Una vez eliminado el sobrenadante, se añade un mililitro de CSM a las células del vórtice. Granular las células por centrifugación y lavar en un mililitro de tampón CAS.
Después de la centrifugación, aspire el sobrenadante a aproximadamente 200 microlitros. Agregue un mililitro de tampón CAS a las muestras en vórtice y alícuota cinco microlitros para el recuento de células. Después de centrifugar las células y aspirar el sobrenadante a 50 microlitros, vuelva a suspender las células en tampón CAS hasta una concentración final de 1 millón de células por mililitro y agregue perlas de calibración para lograr una concentración final de 0,1x.
Cargue la muestra en el citómetro de masa para recopilar datos utilizando un caudal de 400 a 500 celdas por segundo y normalice los datos después de la recolección. Si es necesario, concatene los archivos individuales de citometría de flujo, estándar o FCS para cada muestra en un solo archivo. Identifique las células individuales mediante la activación de eventos positivos del intercalador de iridio.
Seleccione los eventos que sean negativos para el cisplatino para compuerta las células vivas. Determinar la población de interés y cuantificar la proporción relativa de células madre y progenitoras. Para realizar análisis de alta dimensión, exporte la población de interés y utilice algoritmos de agrupación en clústeres.
Para el análisis de desplazamiento X, descargue el paquete de software Vortex y Java de 64 bits. Cargue las poblaciones de celdas exportadas en una base de datos local y defina los parámetros de agrupación en clústeres. Para visualizar las relaciones espaciales entre las poblaciones de células dentro de los clústeres de desplazamiento X, realice un diseño dirigido por fuerza.
El análisis de CyTOF identificó una secuencia de cuatro poblaciones, células madre y poblaciones progenitoras del uno al tres. Las poblaciones progenitoras P1 y P2 corresponden a células progenitoras cada vez más maduras. P3 fue identificada previamente, pero no caracterizada debido a su baja abundancia.
La dinámica de las células madre y progenitoras post-lesión se analizó utilizando CD9 por CD104 mediante diagramas de puntos axiales. Se observó un aumento notable en la población de células madre en el tercer día, lo que sugiere expansión. Esto fue respaldado por una mayor incorporación de yododesoxiuridina, lo que indica proliferación celular, y una mayor expresión de MyoD, como lo muestra la superposición de colores.
Se identificaron células madre activadas marcadas por altos niveles de CD98, CD44, MyoD y yododesoxiuridina, lo que subraya su alta proliferación y estado activado al tercer día después de la lesión.
