Para comenzar, limpie a fondo todas las áreas de la incubadora y la bomba peristáltica con desinfectante para garantizar un ambiente casi estéril. A continuación, enjuague cada tubo con 700 microlitros de PBS con magnesio y calcio, seguidos de 500 microlitros de C2 o medio acondicionado con CE. Utilice el tubo con la distancia corta desde el bloqueo del señuelo hasta el tapón de la bomba peristáltica para la cavidad izquierda y el tubo con la otra simetría para la cavidad derecha.
Después de recuperar el biochip con células HUVEC y C2BBe1 de la incubadora, realice un intercambio de medio con 350 microlitros para cada cámara. A continuación, mueva los tapones del sitio inferior al superior. Agregue 350 microlitros de los medios frescos a la cámara inferior del biochip.
Después de eso, retire todos los enchufes y llene todos los puertos hasta la parte superior. Comenzando en la cavidad izquierda, inserte el adaptador de bloqueo de señuelo en el puerto del biochip para conectar el primer tubo al puerto derecho de la cámara superior. A continuación, conecte el segundo tubo al puerto izquierdo de la cámara inferior.
A continuación, tome un depósito y agregue una pequeña gota de medio de cultivo celular al fondo del depósito. A continuación, inserte el depósito en el lado opuesto del primer tubo y repita para la otra cámara. Una vez que todos los puertos estén conectados a un tubo o depósito, llene los depósitos con 3,5 mililitros de medio de cultivo celular.
Luego coloque el lado suelto del tubo, que tiene la tapa conectada a él, en la parte superior del depósito para cerrar el sistema microfluídico de cada cámara. Transporte el biochip a la bomba peristáltica. Usando los tapones de la bomba peristáltica, conecte cada tubería a la bomba peristáltica para que el medio fluya desde el depósito hacia la cavidad y regrese a través de la bomba.
A continuación, perfunda cada cámara con un caudal de 50 microlitros por minuto. Una vez completada la preprofusión, detenga la bomba peristáltica. Retire la tapa conectada al tubo de cada depósito y colóquela sobre un pañuelo estéril junto a la bomba.
Después de eliminar todo el medio, llene los depósitos con 2 mililitros de medio recién preparado. Vuelva a conectar el tubo y la tapa y continúe la perfusión circular a un caudal de 50 microlitros por minuto durante 24 horas adicionales. Una vez parada la bomba peristáltica, abra los depósitos de todas las cavidades.
Vacíe los depósitos y desconecte los tubos y los depósitos del biochip. Lavar las cavidades microfluídicas con 500 microlitros de PBS frío con magnesio y calcio dos veces por cámara. Agregue 500 microlitros de metanol helado a todas las caries.
Después de abrir el chip, corte o retire la lámina adhesiva del biochip. Cortar el tejido que contiene la membrana de PET por la mitad para teñirlo en paralelo con diferentes paneles inmunológicos. Con pinzas de precisión, transfiera cada pieza de membrana a un pocillo separado en una placa de 24 pocillos con una solución de bloqueo y permeabilidad.
Luego, transfiera las piezas de la membrana a un portaobjetos de vidrio limpio dentro de una cámara húmeda. Agregue 50 microlitros de solución de anticuerpo primario preparada y tinte a cada pieza de membrana. Una vez que las muestras se transfieren a una placa de 24 pocillos, lave las membranas dos veces durante 5 minutos con solución de lavado, luego con PBS que contiene magnesio y calcio.
Usando un medio de montaje de fluorescencia y un cubreobjetos, monte las piezas de membrana en un portaobjetos de vidrio limpio y guárdelas a 4 grados Celsius hasta obtener imágenes microscópicas. Después de cinco días de profusión, el ADN nuclear teñido con DAPI mostró macrófagos derivados de monocitos completamente diferenciados que expresaban CD68 distribuidos por todo el tejido vascular. Los HUVEC crearon una capa confluente que muestra la integridad del tejido mediante la formación de uniones de adherencia, como la VE-cadherina.
Además, el factor de von Willebrand es altamente expresado por los HUVEC. Después de cinco días de profusión, las células C2BBe1 formaron capas de células epiteliales polarizadas que expresan las proteínas de unión E-cadherina y ZO-1. El crecimiento tridimensional de las estructuras vellosas y criptas del epitelio se puede detectar en las secciones x e y de la pila Z después de seis días de perfusión.
