Aislamiento de fracciones mitocondriales enriquecidas a partir de cultivos celulares y muestras de tejido de animales pequeños para ensayos de actividad en gel

Para comenzar, vuelva a suspender el pellet de celda empaquetado en un volumen de tampón hipotónico igual a siete veces el volumen del pellet de celda. Transfiera la suspensión celular a un homogeneizador Potter-Dounce e incube en hielo durante dos minutos, permitiendo que las células se hinchen. Rompa las membranas celulares realizando de 8 a 10 golpes en el homogeneizador acoplado a un mortero de teflón accionado por motor que gira a 600 RPM.

Agregue un volumen igual de tampón hipertónico a la suspensión celular para generar un entorno isotónico. Transfiera el homogeneizado a un tubo de 10 a 15 mililitros. Centrifugar a 1.000 g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados y recoger el sobrenadante en un tubo de polipropileno de 1,5 mililitros.

Para recoger la fracción bruta mitocondrial, centrifugar en un microfuge a 16.000 g durante dos minutos a cuatro grados centígrados. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet enriquecido con mitocondrias con 0,5 mililitros de tampón A. Combine el contenido de dos tubos en uno y centrifugue como se demostró anteriormente. Después de la última centrifugación, vuelva a suspender el pellet en 300 microlitros de tampón A. Cuantifique la concentración de proteínas mitocondriales mediante el ensayo de Bradford.

Con unas tijeras, corte de 20 a 30 miligramos de tejido animal. Lavar el tejido de tres a cuatro veces en tampón de homogeneización con la ayuda de un colador, teniendo cuidado de no perder los trozos más pequeños. Transfiera los trozos de tejido con tampón al homogeneizador.

Para el hígado, el bazo y los tejidos renales, realice de cuatro a seis golpes hacia arriba y hacia abajo en el LVM Potter con un mortero de teflón motorizado a 600 RPM.