Comience por resuspender las fracciones mitocondriales obtenidas de cultivos celulares o tejidos de mamíferos en tampón de muestra nativo azul para obtener una concentración de proteína de alrededor de 10 miligramos por mililitro. Para solubilizar las membranas mitocondriales, agregue digitonina para obtener una proporción de cuatro gramos de digitonina por gramo de proteína mitocondrial. Mezclar mediante un pipeteo suave e incubar en hielo durante cinco minutos.
Centrifugar la suspensión en una microfuga a 20.000 g durante 25 minutos a cuatro grados centígrados para eliminar el material insoluble. Recoja el sobrenadante en un tubo nuevo, luego agregue 5%Coomassie blue G-250, equivalente a un tercio del volumen de resuspensión inicial, y mezcle por pipeteo. Agregue un tampón de cátodo frío A en la cámara superior del aparato de electroforesis y un tampón de ánodo en la cámara inferior.
Cargue de 30 a 100 microgramos de proteína mitocondrial en los pocillos en un gel de poliacrilamida. Después de la electroforesis, coloque el gel en una caja de plástico. Agregue suficiente volumen de solución de ensayo de actividad en gel apropiada para cubrir el gel e incube a temperatura ambiente agitando suavemente, protegiéndolo de la luz.
Cuando se hayan desarrollado las bandas adecuadas, retire la solución de ensayo. Lavar el gel dos veces con agua destilada antes de fijarlo con un 40% de metanol y un 10% de ácido acético durante 30 minutos. El análisis del ensayo de actividad en gel reveló distintos patrones de ensamblaje de supercomplejos en ratones y células humanas.
El complejo libre 1 se observó en células de ratón, mientras que no fue detectable en las mitocondrias humanas. Los patrones del complejo 4 fueron similares en las líneas celulares humanas, pero variaron en las líneas celulares de ratón debido a una variante mutante de SCAF1.
