Este método puede ayudarnos a abordar preguntas clave sobre el papel de las vesículas extracelulares in vivo, proporcionándonos una fuente de vesículas que son representativas del microambiente tisular local. Los estudios de vesículas extracelulares dentro del entorno tisular pueden mejorar nuestra comprensión de las funciones fisiológicas de las vesículas extracelulares y sus alteraciones en los procesos fisiopatológicos in vivo. Una demostración visual de la cannulación de la vena porta es útil ya que el pequeño tamaño de la vena dificulta la manipulación de la vuelta.
Demostrando el procedimiento con el Doctor Kaori Ishiguro estará Irene Yan, una tecnóloga de investigación de mi laboratorio. Antes de comenzar el procedimiento, asegure las extremidades de un ratón anestesiado y conecte la aguja del calibre 23 de una colección de sangre alada establecida en el extremo libre de un pedazo de tubo de la bomba de jeringa. Limpie la piel abdominal del ratón con 70% de etanol y una almohadilla de alcohol y use tijeras para abrir el ratón desde la parte anterior del pecho hasta el hueso pélvico, teniendo cuidado de no dañar ningún órgano interno.
Utilice un aplicador con punta de algodón para mover suavemente los intestinos hacia el lado derecho de la cavidad abdominal para exponer la vena porta y la vena cava inferior y utilizar fórceps curvos para colocar un hilo debajo de la vena porta. Ate un nudo libremente en la sutura para prepararse para el cinching después de la cannulación y llene la cánula con 40 grados Celsius HBSS hasta que la solución llegue a la punta de la aguja de la cánula. Inserte la cánula en la vena porta de cinco a 10 milímetros por debajo de la ligadura y asegure la cánula con la sutura.
Inicie la perfusión a un caudal de uno a dos mililitros por minuto. Si la cánula se colocó correctamente, el hígado comenzará a blanquearse. Cortar la vena cava inferior y dejar que el líquido excesivo dentro del hígado drene.
Aumente lentamente el caudal a ocho mililitros por minuto hasta que se hayan perfundido 50 mililitros completos de HBSS a través del hígado durante los próximos cinco minutos. Justo antes de que se acabe el HBSS, cambie la colagenasa de 40 grados Celsius recién preparada y utilice fórceps para aplicar presión transitoria a la vena cava inferior en intervalos de cinco segundos para hacer que el hígado se hinche y para ayudar con la digestión y la disociación de los tejidos. A medida que la digestión progresa, el hígado se hinchará y se volverá blanco.
Cuando los restos estén deprimidos después de un sondeo suave con un aplicador con punta de algodón, detenga la bomba y retire la cánula. Retire la vesícula biliar del hígado, teniendo cuidado de no rasgar el tejido de la vesícula biliar, y utilizar tijeras y fórceps limpios para cosechar el hígado en un plato de cultivo estéril de 10 centímetros de PBS. Después de un lavado suave, transfiera el hígado a un nuevo plato de cultivo de 10 centímetros que contenga la solución de colagenasa fresca cuatro y use dos fórceps limpios para desgarrar el hígado mientras agita suavemente para disociar las células del tejido hepático.
Cuando todo el órgano se haya fragmentado, utilice una jeringa de tres mililitros para triturar la suspensión del tejido hasta que se sacudan los trozos no digeridos del hígado. Vierta la solución celular resultante a través de un colador de malla de nylon de 70 micras en un tubo cónico de 50 mililitros, lavando el plato con HBSS para recoger las células restantes. Acople el lavado con la suspensión de una sola célula y retire los hepatocitos por centrifugación.
A continuación, transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de 50 mililitros. Para eliminar cualquier otra célula, centrifugar el sobrenadante antes de transferirlo a un nuevo tubo cónico de 50 mililitros. Retire las células muertas con otra centrifugación y transfiera el sobrenadante a un tubo de fondo redondo para eliminar los restos y agregados celulares.
Ahora transfiera el sobrenadante en un tubo de policarbonato ultra centrífuga y resuspender el pellet en unos 20 mililitros de PBS para una segunda y última centrifugación ultra. A continuación, resuspender el pellet de nanovesícula extracelular en un mililitro de PBS para menos 80 grados Celsius almacenamiento si las vesículas no se analizarán inmediatamente. A partir de un solo hígado de ratón, este método produce una concentración de vesícula extracelular de tejido que oscila entre 1,74 y cuatro veces 10 y el duodécimo con una media de 3,46 veces 10 a las doce partículas por mililitro, según lo determinado por el análisis de seguimiento de nanopartículas.
El tamaño medio de las vesículas extracelulares del tejido hepático aislado es de 157,7 nanómetros con un tamaño de modo de 144,5 nanómetros y vesículas extracelulares que oscilan entre 100 y 600 nanómetros por análisis de seguimiento de nanopartículas. Las vesículas extracelulares que se aíslan utilizando este enfoque son adecuadas para aplicaciones posteriores y la caracterización posterior puede incluir evaluaciones morfológicas por electromicroscopia o análisis de sus marcadores de superficie o contenido.
