Para comenzar, descongele la trombina y la aprotinina en hielo y coloque un vial de fibrinógeno en un baño de agua a 37 grados centígrados. Con una pipeta, homogeneícelos debajo del capó. Luego, con unos alicates estériles, coloque los insertos en los pocillos de cultivo, dejando al menos una columna o fila vacía en la placa.
A un tubo de 0,25 mililitros, agregue primero los volúmenes necesarios de fibrinógeno y aprotinina. A continuación, agregue la trombina en el tubo y enjuague rápidamente dos veces sin crear burbujas. Dibuja todo el contenido del tubo.
Coloque la pipeta verticalmente sobre el centro del inserto y enjuague suavemente una mezcla de reactivos sin generar burbujas. Incubar durante al menos una hora a 37 grados centígrados para solidificar hasta que la mezcla se vuelva blanca opaca. Para la siembra de organoides, confirme bajo un microscopio que las micromasas forman masas celulares esféricas, con un coro compacto rodeado por un halo de menor densidad de progenitores tímicos tempranos.
Corta la punta de un cono P200 y lávala con una solución antiadherente. Incline la placa a una posición casi vertical y aspire las masas celulares desde el fondo del pocillo. Depositar delicadamente la masa en la parte superior de los hidrogeles sin tocar el gel.
Compruebe al microscopio que no quede ningún organoide en los pocillos de las placas. Luego agregue lentamente un cuarto del volumen del medio de cultivo en la parte superior del hidrogel sin tocarlo, y agregue los 3/4 restantes en el fondo del pocillo. Agregue un mililitro de PBS a los pocillos de cultivo vacíos para mantener la humedad en la placa e incube a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono.
Los organoides forman estructuras esféricas a oblongas y ocasionalmente se fusionan para formar estructuras más grandes en los hidrogeles.
