Para empezar, obtenga un ratón SMARTA CD 45.1 positivo para CD 45.1 de seis a ocho semanas de edad e inyecte 200 microgramos de péptido LCMV GP 61-77 en 100 microlitros de medio RPMI por vía intravenosa. Después de adquirir los esplenocitos del ratón, suspenderlos en 2%RPMI para lograr una densidad celular de uno por 10 a las células T por mililitro y colocar el tubo con células en hielo. Dispense 50 microlitros de suspensión celular junto con 150 microlitros de tampón de tinción a cada pocillo de una placa de 96 pocillos de fondo redondo.
Centrifugar la placa de 96 pocillos a 800 G durante un minuto a cuatro grados centígrados y decantar cuidadosamente el sobrenadante. Agite la placa y agregue 200 microlitros de tampón de tinción a cada pocillo. Después de peletizar las células, resuspenderlas e incubarlas con cóctel de anticuerpos de superficie en hielo durante 30 minutos en la oscuridad.
Después de lavar dos veces, vuelva a suspender las células en 200 microlitros de tampón de tinción y transfiéralas a un tubo de citometría de flujo. Realice un análisis de citometría de flujo para comprobar el estado de activación de las células T positivas para CD4 de SMARTA. A continuación, siembre una vez 10 de las seis células T SMARTA CD4 positivas por pocillo en una placa de 24 pocillos.
Gire las células a 800 g durante tres minutos a cuatro grados centígrados y retire con cuidado el medio sobrenadante. A continuación, agregue un mililitro de medio retrovirus y ocho microgramos de policeno a cada pocillo. Transducir las células a 800 G durante dos horas a 37 grados centígrados.
Después de desechar el medio retrovirus, incubar las células con un mililitro de RPMI precalentado al 10% suplementado con interleucina 2. Transfiera la suspensión celular a un tubo cónico de 15 mililitros y centrifuérrelo. Después de desechar el sobrenadante, vuelva a suspender las células con 2% RPMI para lograr una densidad celular de uno por 10 a la octava célula por mililitro.
Para evaluar la eficiencia de la transducción, se colocaron 50 microlitros de suspensión celular en una placa de 96 pocillos de fondo redondo. Intercélelos en hielo con el cóctel de anticuerpos de superficie, incluidos CD4, V alfa dos y anticuerpos asociados a la etiqueta vectorial. Lave las células y realice la citometría de flujo como se demostró anteriormente.
A continuación, inyecte una vez 10 de las seis células T positivas para CD4 CD4 CD 45.1 SMARTA a un ratón receptor de C57BL/6 por vía intravenosa, seguida de una vez 10 a las seis unidades formadoras de placa de LCMV Armstrong al día siguiente. Después de adquirir los esplenocitos del ratón, tiñirlos para comprobar los marcadores deseados. Para detectar factores transcripcionales, incubar las células con 200 microlitros de paraformaldehído al 2% a temperatura ambiente durante 20 minutos en la oscuridad.
Por último, realizar una citometría de flujo para detectar factores en la etapa temprana de infección aguda por LCMV. Al tercer día después de la infección, se encontró una bifurcación equilibrada de células T auxiliares foliculares y células T colaboradoras 1 entre las células T positivas para MIGR1 SMARTA CD4. Se observó una diferenciación dirigida a las células T auxiliares foliculares predominantes y niveles mejorados de expresión de BCL6 en las células T positivas para MIGR1 BCL6 SMARTA CD4.
