Después de recoger el aserrador de pinos, escarabajos Monochamus alternatus, coloque el escarabajo en un tubo estéril que contenga ramitas frescas. Cría los escarabajos en una incubadora no humidificada a 25 grados centígrados. Después de la incubación, los escarabajos registran una disminución de la alimentación y la movilidad.
Transfiera los escarabajos muertos rígidos a cámaras húmedas. Disecciona los escarabajos con infecciones fúngicas en posiciones principales como antenas, cabeza, tórax, abdomen, alas y patas. Con unas tijeras, corta los tegumentos de cada posición en trozos pequeños.
Presione suavemente la superficie exterior de estas piezas sobre la placa de PDA que contiene antibióticos. Selle la placa con parafilm e incube a 25 grados centígrados hasta que los tejidos estén completamente cubiertos por micelio. A continuación, transfiera la colonia individual de acuerdo con las propiedades fenotípicas a una nueva placa PDA.
Extraiga el ADN genómico utilizando el kit de aislamiento de ADN genómico de hongos. Prepare la mezcla de PCR con los cebadores ITS1 e ITS4 para amplificar la región rDNA-ITS del ADN. Utilice una cámara para capturar la morfología madura de la colonia pura de hongos en la parte delantera y trasera de la placa PDA.
Arrancar los conidios de las colonias de hongos puros con una aguja de inoculación y transferirlos a un portaobjetos de vidrio con una gota de agua estéril. A continuación, coloque un cubreobjetos sobre la muestra sin introducir burbujas. Corta un bloque de agar de cinco milímetros con un bisturí desde el borde de la colonia de hongos y transfiérelo a un portaobjetos de vidrio limpio con una gota de agua estéril.
Con una aguja fina, separe cuidadosamente los hongos del agar para observar estructuras específicas. Bajo un microscopio óptico, observe el morfo asexual de los hongos, incluida la postura de las hifas, los conidióforos, los fiálidos y los conidios.
