Para comenzar, esterilice la superficie de un escarabajo Monochamus alternatus y Tribolium castaneum hambrientos durante 24 horas con lejía, etanol y agua destilada. Para inducir la infección por hongos, primero, sumerja las ramitas de pino o el salvado de trigo en la suspensión conidial durante 10 segundos. Luego sumerja los escarabajos en la suspensión conidial.
Después del secado, coloque un escarabajo y una ramita en un tubo estéril de 50 mililitros. Cría los escarabajos en una incubadora no humidificada a 25 grados centígrados. Después de la incubación, transfiera los escarabajos muertos a un nuevo tubo de 50 mililitros y coloque un trozo de algodón estéril y húmedo dentro del tubo.
Disecciona los cuerpos de los escarabajos infectados con infecciones fúngicas en posiciones como las antenas, la cabeza, el tórax, el abdomen, las alas y las patas. Corta tapones de disco de cinco milímetros de colonias de hongos maduros. Coloque los tejidos del escarabajo infectado en glutaraldehído al 2,5% previamente enfriado a cuatro grados centígrados durante dos días.
A continuación, lavar las muestras tres veces en tampón de fosfato al 0,1% durante cinco minutos y deshidratar en concentraciones crecientes de etanol durante 10 minutos cada una. Seque las muestras en un liofilizador al vacío y luego observe las estructuras fúngicas bajo un microscopio electrónico de barrido. Trate el salvado de trigo con una suspensión de conidiales durante 10 segundos y, después del secado, transfiéralo a una placa de Petri.
Sumerja los escarabajos T. castaneum en la suspensión conidial durante 10 segundos antes de colocarlos en la placa de Petri que contiene salvado de trigo. Después de la incubación, cuente los escarabajos muertos del plato. Extraiga el ADN genómico de hongos entomopatógenos parásitos utilizando el kit de aislamiento de ADN genómico de hongos.
Usando los juegos de cebadores dados, prepare una mezcla de reacción de PCR para la amplificación específica de genes. Después de la secuenciación, alinee la secuencia de nucleótidos con ClustalX 2. Por último, realizar un análisis filogenético utilizando MEGA 6 basado en el método de máxima verosimilitud.
Hongos parásitos como Aspergillus austwickii, Akanthomyces attenuatus y Scopulariopsis alboflavescens causaron síntomas de infección significativos en M. alternatus. Las observaciones de SEM confirmaron aún más las características morfológicas de estos hongos parásitos en la superficie de los escarabajos. La actividad entomopatogénica mostró tasas de mortalidad significativamente más altas en los hongos parásitos en comparación con el grupo control.
El árbol filogenético multigénico demostró distancias genéticas entre las tres especies de hongos parásitos y otras especies dentro de sus respectivos géneros.
