Después de realizar la inmunohistoquímica en los tejidos FFPE, obtenga imágenes de las secciones con el generador de imágenes de patología digital. Inicie el software para realizar la desmezcla espectral de las imágenes anotadas. Seleccione Archivo, luego haga clic en Abrir imagen y elija los archivos QPTIFF para cargar las imágenes en el software.
Permitir que los sellos marcados como proyectos informados se carguen en el proyecto. Cargue los archivos QPTIFF preparados para la compensación de autofluorescencia. Seleccione la herramienta de autofluorescencia en la imagen para dibujar una línea en la imagen desde el portaobjetos sin teñir a través de estructuras autofluorescentes como eritrocitos y colágeno para compensar la autofluorescencia.
A continuación, vaya a la sección Editar marcadores y colores. Asigne nombres de marcadores que coincidan con el fluoróforo Opal y ajuste la configuración de color a su opción preferida. Seleccione Preparar todo ubicado en la esquina inferior izquierda de la interfaz para iniciar la desmezcla de fluoróforos.
Examine todas las imágenes para comprobar la visibilidad de todas las señales y la finalización exitosa del proceso de desmezcla. Seleccione el icono del globo ocular para apagar y encender todos los marcadores uno por uno para comprobar la calidad. Ahora navegue a la pestaña Exportar y cree un nuevo directorio de exportación vacío haciendo clic en el botón Examinar ubicado debajo del directorio Exportar.
Seleccione TIFF de imagen compuesta e imágenes de componentes de varias imágenes en la pestaña de imágenes para exportar. Vaya a la pestaña Análisis por lotes que se encuentra verticalmente a la izquierda para el procesamiento por lotes de diapositivas y seleccione crear directorios separados para cada elemento en las opciones de exportación. Para agregar diapositivas para el análisis, seleccione Archivos QPTIFF en el botón Agregar diapositivas y cárguelos en el análisis por lotes.
Seleccione Ejecutar para comenzar el procesamiento por lotes de diapositivas. Cree una nueva carpeta que contenga solo los archivos de componentes de la desmezcla espectral, asegurándose de que la estructura jerárquica de carpetas permanezca intacta. Inicie todo el software de visualización de diapositivas.
Haga clic en Crear proyecto en el lado izquierdo y cree o seleccione una nueva carpeta vacía con un nombre apropiado. A continuación, haga clic en Automatizar y elija Mostrar editor de scripts. Copie y pegue el script existente y modifique la ubicación para dirigirlo hacia la carpeta que contiene todos los archivos de componentes de diapositiva.
Seleccione Ejecutar para comenzar el proceso de costura por lotes de diapositivas y, a continuación, permita que se complete. Ahora mueva los archivos OME TIFF generados recientemente al proyecto QuPath y guárdelos como un nuevo proyecto. Cuando aparezca una nueva ventana, seleccione establecer el tipo de imagen como fluorescencia y, a continuación, haga clic en el botón Importar.
Navegue hasta el menú de la izquierda, seleccione una muestra de la lista y haga doble clic para abrir la muestra elegida. Ajuste la intensidad de los canales haciendo clic en el icono Contraste para mejorar la visibilidad. Seleccione todos los canales y opte por restablecer.
Asegúrese de que la autofluorescencia esté desactivada. Para dibujar una región de interés o ROI para el tumor, vuelva a hacer clic en el icono de contraste y, a continuación, seleccione Mostrar escala de grises. Después de eso, seleccione el canal marcador tumoral y ajuste la intensidad para una visibilidad óptima.
Haga clic en la herramienta de pincel para dibujar un ROI alrededor del tumor. Haga clic en una herramienta y ajuste el ROI mientras presiona la tecla alt para suavizar el ROI desde el exterior. Cuando termines, fusiona las partes separadas del tumor en el mismo ROI.
Haga clic con el botón derecho en la anotación ROI de la lista de la izquierda, seleccione Establecer propiedades y proporcione un nombre adecuado. Por ejemplo, tumor. Expanda el ROI para el margen invasivo de la región tumoral seleccionando Objetos, luego Anotaciones y, a continuación, Expandir anotaciones.
Elija el tamaño deseado para el radio de expansión. Seleccione Quitar interior y restringir a primario. Haga clic en el icono de contraste, seleccione el canal de autofluorescencia y ajuste la intensidad para obtener una visibilidad óptima.
Haga clic en la varita y ajuste el ROI mientras presiona la tecla alt para suavizar el ROI desde el exterior y eliminar cualquier fondo que no deba ser parte de este ROI. Haga clic con el botón derecho en la anotación de la lista de la izquierda. A continuación, seleccione Establecer propiedades para asignar un nombre adecuado, como margen invasivo o mensajería instantánea al ROI.
Si lo desea, cambie su color. Para exportar las anotaciones, vaya a la opción Archivo, haga clic en Datos de objeto, Exportar como GeoJSON y seleccione Exportar todos los objetos. Continúe con la selección predeterminada al exportar como colección de entidades y guárdela en una ubicación preferida.
