Para empezar, añade 1,5 mililitros de etanol al 70% a 30 miligramos de partículas de tungsteno de 0,7 micrómetros en un microtubo. Centrifugar la mezcla a 13, 200 g durante 15 minutos. Agregue 1,5 mililitros de agua estéril a las partículas, luego vórtice y centrifuga nuevamente.
Después de desechar el sobrenadante, agregue 500 microlitros de glicerol estéril al 50% a las partículas de tungsteno. Para recubrir las partículas, primero agregue cinco microgramos de un plásmido de dos micras y 15 microgramos de un plásmido bacteriano que contenga la secuencia mitocondrial en un microtubo colocado en hielo. Agregue 100 microlitros de la suspensión de partículas de tungsteno al tubo y al vórtice.
A continuación, añade cuatro microlitros de espermidina de un molar y vuelve a vórtice. Ahora pipetee 100 microlitros de cloruro de calcio de 2,5 molares helados en el tubo. Después de vórtice brevemente la suspensión, incubela en hielo durante 10 minutos.
Centrifugar las partículas de tungsteno a 13,200 G durante 30 segundos a cuatro grados centígrados. Luego, lave las partículas en 200 microlitros de etanol al 100% a menos 20 grados centígrados. Finalmente, vuelva a suspender las partículas de tungsteno en 60 a 70 microlitros de etanol 100% a temperatura ambiente.
Para preparar los materiales biológicos, coloque seis soportes de macroportadores esterilizados en una placa de vidrio estéril. Utilice un par de pinzas estériles para insertar los macroportadores en cada uno de los seis soportes de macroportadores. Pipetee 10 microlitros de partículas de tungsteno codificadas por ADN en cada superficie del macroportador y distribúyalo uniformemente por toda la superficie con la punta de la pipeta.
Inocular la cepa del receptor de levadura rho cero en dos mililitros de medio YPR. Cultive el cultivo durante la noche a 30 grados centígrados en una rueda giratoria. Al día siguiente, transfiera 300 microlitros del cultivo a un tubo que contenga 30 mililitros de medio YPR fresco.
Coloque el cultivo en un agitador giratorio durante dos noches a 30 grados centígrados y 200 revoluciones por minuto hasta que el cultivo esté saturado. Centrifugar las células de levadura a 600 g durante cinco minutos a temperatura ambiente. Vuelva a suspender las células en 600 microlitros de medio YPD después de desechar el sobrenadante.
Ahora use un mango de vidrio estéril para esparcir 100 microlitros de la suspensión de células de levadura en una placa sólida de medio de bombardeo. Después de esparcir todos los cultivos, incube las placas a temperatura ambiente durante una a tres horas antes del bombardeo.
