Después de la calibración del sistema de respirometría, reemplace MiR05 de cada cámara con 2,1 mililitros de solución nueva de MiR05. En el software de respirometría, introduzca los ajustes del instrumento. Establezca el nombre del archivo y la configuración de guardado.
En el siguiente cuadro de diálogo, introduzca la información de la muestra, incluido el peso de cada muestra añadida a cada cámara. Ahora, abra la ventana de calibración de oxígeno, haga clic en copiar del archivo y seleccione el archivo de calibración de aire guardado. A continuación, haga clic en el botón calibrar y copiar al portapapeles.
Con pinzas finas, transfiera cuidadosamente los haces de fibras musculares, previamente aislados del ratón, a la solución respiratoria. Coloque los tapones en la cámara y empújelos hasta la mitad del fondo para semicerrar la cámara. Una vez que las juntas tóricas de los tapones se enganchen en la pared de la cámara, use un movimiento de torsión mientras empuja hacia abajo para cerrar.
Cuando la cámara está medio cerrada, se observa una pequeña burbuja de aire en la parte superior de la cámara. Llene una jeringa de plástico de 10 mililitros con oxígeno puro de un tanque de oxígeno. Coloque la aguja larga y roma en la jeringa, luego inserte la aguja en la primera cámara y administre lentamente aproximadamente un mililitro de oxígeno.
Controle la concentración de oxígeno de la cámara. Cuando la concentración alcance de 350 a 400 nanomoles por mililitro, gire suavemente el tapón mientras empuja hacia abajo para cerrar completamente la cámara. Observe la cámara y asegúrese de que no queden burbujas de aire.
Para normalizar los datos de flujo de oxígeno a la masa de tejido desde el menú de diseño, seleccione el diseño 06 flujo específico por unidad de muestra. Asegúrese de que la concentración de oxígeno y el flujo de oxígeno se hayan estabilizado después de la adición de oxígeno para comenzar la medición de la respiración. Con una jeringa de vidrio de 10 microlitros, agregue 2,5 microlitros de malato molar de 0,8 a cada cámara.
Presione F4 para marcar la línea de tiempo y etiquétela con M.Record flujo de oxígeno estable durante uno o dos minutos. Para glucolítico aeróbico, agregue 10 microlitros de glutamato de dos molares y cinco microlitros de piruvato de dos molares a cada cámara. Presione F4 para marcar la línea de tiempo y etiquete la marca con GP. Registre el flujo de oxígeno estable durante uno o dos minutos.
Agregue 10 microlitros de glutamato 2 molar y 10 microlitros de palmitoilcarnitina 10 milimolar a cada cámara para sustratos de ácidos grasos. Presione F4 para marcar la línea de tiempo y etiquete la marca con GPC. Registre el flujo de oxígeno estable durante uno o dos minutos.
Con una jeringa de vidrio de 25 microlitros, agregue 20 microlitros de ADP de 0,5 molares a cada cámara. Presione F4 para marcar la línea de tiempo y etiquete la marca con ADP. Registre el flujo de oxígeno estable durante uno o dos minutos.
Ahora, agregue 20 microlitros de un succinato molar a cada cámara. Presione F4 para marcar la línea de tiempo y etiquétela con S.Registre el flujo de oxígeno estable durante uno o dos minutos. Usando una jeringa de vidrio de 10 microlitros, agregue cinco microlitros de cuatro milimolares de citocromo c a cada cámara.
Presione F4 para marcar la línea de tiempo y etiquete la marca con el citocromo c. Registre el flujo de oxígeno estable durante uno o dos minutos. Valoración en 3 bolos de un microlitro de un milimolar de FCCP, utilizando una jeringa de vidrio de 10 microlitros.
La edición FCCP da como resultado una breve disminución en los niveles de flujo de oxígeno. Espere a que el flujo de oxígeno aumente y se estabilice antes de grabar. Presione F4 para marcar la línea de tiempo y marque la etiqueta con FCCP.
Registre el flujo de oxígeno estable durante uno o dos minutos. Una vez finalizado el ensayo, gire suavemente y tire del tapón hacia arriba para retirarlo. Enjuague la cámara tres veces con agua ultrapura, seguidas de tres veces con etanol al 70%.
Coloque los tapones en las cámaras hasta que se sienta resistencia, pero no las cierre por completo. Luego, tapa los tapones. Guarde el archivo de ensayo y desconecte el instrumento del software.
Finalmente, apague el respirómetro. En muestras murinas debidamente preparadas, la adición de citocromo c post-ADP no afectó el flujo de oxígeno, lo que confirma la integridad de la membrana mitocondrial externa. Sin embargo, cuando las muestras de tejido no se prepararon adecuadamente, la adición de citocromo c después de la ADP condujo a un aumento del 40% en el flujo de oxígeno, lo que indica daño a la membrana mitocondrial externa.
