Para comenzar, coloque una placa 3 veces 10 a la potencia de las células de fibrosarcoma 6MCA205 en 10 mililitros de medio de crecimiento completo en una placa de Petri de 100 milímetros. Irradiar las células con luz ultravioleta e incubar a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono durante al menos seis horas para dejarlas morir. Lavar in vitro las células dendríticas diferenciadas, o CD, dos veces, a 1100 g durante cuatro minutos en un medio de crecimiento completo.
Cuente las CD vacías derivadas de la médula ósea utilizando la prueba de exclusión de colorante azul de tripán. Centrifugar las células cancerosas irradiadas a 1100 g durante cinco minutos. Establezca el cocultivo de CD vacías con células apoptóticas irradiadas en una proporción de dos a uno en una placa de 12 pocillos durante 24 horas a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono.
Al día siguiente, lavar las células dos veces a 1100 g durante cinco minutos en 10 mililitros de medio de crecimiento completo en tubos de 15 mililitros. Para la tinción de la superficie celular, vuelva a suspender las CD derivadas de la médula ósea en 20 microlitros de tampón FACS frío e incube durante 20 minutos a cuatro grados centígrados en la oscuridad. Después de lavar las células con tampón FACS, agregue 100 microlitros de tinte de infrarrojo cercano que contiene PBS que contiene vitalidad durante 30 minutos.
Lave las celdas una vez con PBS antes de volver a suspenderlas en el tampón FACS. Identifique las celdas de interés en función de sus propiedades FSCA y SSCA. A continuación, trace FSCA y FSCH para excluir los dobletes y grupos de células del análisis.
Traza un área de filtro de paso de banda de emisión de 780 a 60 nanómetros y SSCA para eliminar las células muertas. Utilizando filtros de paso de banda de emisión de 575 a 26 y de 530 a 30 nanómetros, detecte la positividad celular para el marcador CD11C y el enlazador de células fluorescentes PKH67 en dos gráficos de densidad de parámetros. Después del recuento, cultive las células T CD8 con CD derivadas de la médula ósea que habían absorbido células apoptóticas MCA205 en una proporción de dos a cinco a uno a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono durante 72 horas.
Añadir EdU al medio de cocultivo a una concentración final de 10 micromolares e incubar durante 16 a 20 horas. Centrifugar el cebado cruzado CD8 dos veces a 1100 G durante cinco minutos y teñir los marcadores de superficie en tampón FACS frío durante 20 minutos a cuatro grados centígrados en la oscuridad. Después de lavar las células dos veces en tampón FACS, vuelva a suspenderlas en 100 microlitros de PBS que contienen el tinte acuático fijable vitalmente durante 30 minutos.
Lavar las suspensiones celulares una vez con tres mililitros de 1%BSA en PBS en tubos de flujo. Añadir 100 microlitros de paraformaldehído al 4% durante 15 minutos para la fijación celular. Incubar las células en 100 microlitros de permeabilización a base de saponina y lavar el reactivo durante 15 minutos.
Agregue 500 microlitros del cóctel de reacción e incube durante 30 minutos en la oscuridad. Después del lavado, vuelva a suspender las células en 100 microlitros de permeabilización a base de saponina y reactivo de lavado. Identifique las celdas de interés en función de sus propiedades FSEA y SSEA.
A continuación, trace FSEA y FSEH para excluir los dobletes y grupos de células del análisis. Traza un área de filtro de paso de banda de emisión de 525 a 50 nanómetros y SSCA para eliminar las células muertas. Usando gráficos de densidad de filtro de paso de banda de emisión de 530 a 30 y 575 a 26 nanómetros, detecte la positividad de las células para CD8a y CD3.
Analice las celdas para la incorporación de Alexa Fluor 647 EdU en un histograma de un solo parámetro utilizando un filtro de emisión de paso de banda de 660 a 620 nanómetros. Las células dendríticas CD11c positivas engulleron eficazmente las células cancerosas apoptóticas MCA205 a 37 grados Celsius, lo que demuestra una fagocitosis dependiente de la temperatura en las primeras etapas del ciclo de inmunidad del cáncer. Después de la fagocitosis, las células dendríticas mostraron niveles aumentados de CD86 y MHC-II junto con niveles reducidos de PDL1.
La expansión clonal de los linfocitos T CD8 positivos, una vez activados por los linfocitos dendríticos maduros, fue evidente, con una tasa de proliferación de aproximadamente el 20%. Utilizando modelos de tumores en chip, se observó la respuesta quimiotáctica de estas células T hacia las alarmas liberadas por las células cancerosas.
