Después de recuperar los CD8 cebados de cocultivo, centrifugarlos a 1100 g durante 10 minutos en 10 mililitros de medio de crecimiento completo. Resuspenda 1 x 10 a la potencia de 7 células en total en 100 microlitros de microperlas de eliminación de células muertas e incube durante 15 minutos a temperatura ambiente. Coloque las columnas de separación en el separador magnético y enjuáguelas con tampón aglutinante.
Transfiera las suspensiones de celdas a columnas de separación y recoja el flujo a través. Después de lavar la columna, recoja las celdas sin etiquetar que pasen y combínelas con el flujo de paso recopilado anteriormente. CD8 vivo enriquecido con centrífuga a 1100 g durante cinco minutos en un medio de crecimiento completo.
Después del recuento, cultive células CD8 cebadas con células MCA205 frescas en una proporción de dos a uno en placas de 12 pocillos, e incube a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono durante 72 horas. Antes de recuperar el efector CD8, agregue monensina y brefeldina a los cocultivos de células inmunitarias cancerosas durante seis horas. A continuación, recupere el efector CD8 y centrifugue dos veces a 1100 g durante cinco minutos.
Vuelva a suspender las células en tres mezclas diferentes de anticuerpos primarios preparadas en tampón FACS frío e incube durante 20 minutos a cuatro grados centígrados, protegiéndolos de la luz. Añadir 100 microlitros de solución de fijación al paladar celular de Mix C e incubar durante 20 minutos a cuatro grados centígrados en la oscuridad. Vuelva a suspender las células en un tampón de lavado en frío e incube durante 30 minutos a cuatro grados centígrados.
Después de lavar las células dos veces en tampón FACS, agregue 100 microlitros de PBS que contengan el Vitality Fixable Aqua Dye a los gránulos de las celdas durante 30 minutos. Identifique las celdas de interés en función de sus propiedades FSCA y SSCA. A continuación, trace FSCA y FSCH para excluir los dobletes y grupos de células del análisis.
Trace un filtro de paso de banda de emisión de 525/50 nanómetros y SSCA para eliminar las células muertas, utilizando filtros de paso de banda de emisión de 660/20 y 780/60 nanómetros, detecte la positividad celular para CDAA y CD3 en dos gráficos de densidad de parámetros. Además, analice las células en busca de marcadores CD44, CD25 y CD69 para el marcador CD137, y de interferón gamma positivo y granzima B para Mix A, B y C, respectivamente. Para el ensayo de destrucción tumoral, complemente el medio de cocultivo con un tinte de cuantificación de muerte celular en tiempo real.
Después de calentar la placa a 37 grados Celsius en el sistema de análisis de células vivas, realice el escaneo de datos cada dos horas durante un máximo de 72 horas. Centrifugar las células dos veces a 1000 g durante cinco minutos. Tiñir las células para marcadores de superficie con 20 microlitros de tampón FACS frío e incubar durante 20 minutos a cuatro grados centígrados en la oscuridad.
A continuación, añada el colorante de vitalidad yoduro de propidio para teñir las células y obtener una estrategia de compuerta. Identifique las celdas de interés en función de sus propiedades FSCA y SSCA. A continuación, trace FSCA y FSCH para excluir los dobletes y grupos de células del análisis.
Utilice un filtro de paso de banda de emisión de 450/50 nanómetros para detectar células cancerosas negativas para CD45. En un histograma de un solo parámetro, utilizando un filtro de emisión de paso de banda de 610/620 nanómetros, analice las células para determinar la incorporación de yoduro de propidio como intensidad fluorescente media. A través de la citometría de flujo multiparamétrica, se mejoraron los niveles de expresión superficial del marcador de activación temprana CD69, los marcadores de activación tardía CD44 y CD25, la expresión de membrana de CD137 y CD107, los marcadores de reactividad tumoral.
Los niveles intracelulares de moléculas citotóxicas, granzima B e interferón gamma positivo se incrementaron progresiva y significativamente, alcanzando un pico de expresión a las 72 horas de cocultivo. Las células MCA205 cocultivadas por afines experimentaron niveles significativos de muerte mediada por efectores CD8.
